• Author / Uploaded
• Sebastian Martinez Cardona

Citation preview

.1.3.6. ELECTROFORESIS La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular. 1.

Fundamento. Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente,

la migración electroforética de las moléculas será ensanchamiento del frente se vera reducido también.

mas

lenta,

pero

el

1.2

Métodos electroforeticos zonales. Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más utilizados son: 1.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. 1.2.2

Electroforesis

en

geles

de

gradientes. El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones

uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija. (Diapositiva n 9) 1.2.4 Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos. 1.2.5

Electroforesis

capilar. La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten

obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución . La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es online. Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.

1.2.6

Isoelectroenfoque. Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH. 1.2.7 Electroforesis bidimensional. La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida. 1.3 Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del

reactivo,

tiempo

de

corrida

y

preparación

de

1.4

las

muestras. Bibliografía.

. E.D.P. de Robertis, E.M.F. de Robertis I y II. Biología Molecular y Celular . Krause, U., Thomson-carter, F.M. ? Pennington, T.H. 1996. Molecular Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 by Pulsed-Field Gel Electrophoresis and Comparison with That by Bacteriophage Typing. J.Clin. Microbiol. 34:959961 Berkelman T., Stenstedt T. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles & methods. Amersham Pharmacia Biotech Inc. 1998. Recursos CD-ROM

electrónicos: Poutou,

R.2003.

Biología

molecular.

Archivos

quick

time.

http:/www.uib.es/depart/dba/genetics/practicas http:/www.indibo.esm/organizacionlaboratorio3.ppt http:/www.terion.dna.uba.ar/rbma/agarosa.htm http:/www.

Amershanbiosciences.com/aptrix/uppo1077.nof/contect

La electroforesis capilar, es una técnica instrumental que se utiliza en la química para la separación de distintas moléculas que se encuentren incluidos en una misma disolución. La separación se produce en un tubo vacío de pequeño diámetro, de manera que es precisamente de ahí de donde toma su nombre, ya que el tubo es a modo de capilar, dentro del cual se colocarán las moléculas que deben ser separadas, también llamadas, analitos, así como el tampón o el electrolito que producirá hará posible la conducción de la corriente. La electroforesis convencional fue y continúa siendo de gran utilidad; pero sin embargo, este tipo de separación electroforética es altamente laboriosa, así como lenta y de difícil automatización, no proporcionando además, resultados cuantitativos precisos. La investigación, así como la aplicación de la electroforesis llevada a cabo en capilares creció de gran manera durante la segunda mirad de los años ochenta, hecho que estuvo unido a la aparición de diferentes instrumentos comerciales. La electroforesis capilar da lugar a una separación de volúmenes de muestra que son considerablemente pequeños, que van del 0.1 a los 10 nl, que contrasta con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra que vienen medidos en orden de microlitros. La separación por electroforesis capilar, además es bastante rápida y de elevada resolución. Además, las especies que se separan eluyen de uno de los extremos del capilar, pudiendo usarse detectores cuantitativos como los utilizados en HPLC, en el lugar de las técnicas, a menudo incómodas, de coloración utilizada en la electroforesis capilar. La separación por electroforesis capilar se lleva a cabo a través de la relación existente entre la masa y la carga de las distintas moléculas participantes. Para que esto sea factible, debemos aplicar un diferencial de potencial, de unos 100 a unos 500 V/cm. Ambos extremos el capilar harán que las moléculas se muevan de un lado al otro, lo que se conoce como movilidad electroforética, de manera que puedan ir separándose entre sí. También dentro del capilar, cabe mencionar otro fenómeno que tiene lugar, es el caso del flujo electroosmotico, que se produce debido a la carga que posee la superficie interna del capilar. Dicho flujo es el mismo a lo largo de todo el capilar, por lo que afecta de igual manera a todas las moléculas, haciendo que estas se vean arrastradas hacia uno de los extremos. De esta manera la separación se verá influenciada por el flujo electroosmótico y por la movilidad electroforética de cada uno de las moléculas participantes en el proceso. La eficacia del proceso, así como la velocidad, pueden verse mejorados a través de la optimización de los distintos factores, como pueden ser la temperatura o el voltaje, el

disolvente donde se disuelve la muestra, etc. Por lo general se consiguen tiempos de análisis más bien bajos, al compararlos con otros tipos de técnicas de separación, como puede ser la cromatografía de gases o líquidos. También el consumo de nuestra muestra y reactivos es bastante menor, por lo cual se puede considerar como una técnica limpia. Es una técnica bastante versátil, pues puede ser utilizada para separar cualquier muestra de compuesto.

Lee todo en: Electroforesis capilar | La Guía de Química http://quimica.laguia2000.com/general/electroforesis-capilar#ixzz2UG7bRKx2 . Electroforesis Capilar (CE) La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta técnica está representada en el siguiente esquema: El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias. Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un softwarealtamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor. Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se pueden utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes. Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar: La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. Estos geles están contenidos en un tubo capilar. Los geles utilizados son también de agarosa y poliacrilamida. Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido, probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño. En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Su principal inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros.

Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este método se basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica, generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado. La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento. Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra. En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Esta característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema, dado que no hay un electrolito de soporte. Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. Se requiere usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica. La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado, por lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión. En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que simplifica significativamente el equipo. Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar: 



Electrocromatografía rellena, en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno. Cromatografía capilar electrocinética micelar. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la separación.

En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada. Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación.

Sistema de Electroforesis Capilar

Requiere de una instrumentación relativamente simple: una fuente de alto voltaje, un capilar cuyos extremos se encuentran sumergidos, junto con dos electrodos, en dos viales que contienen una solución amortiguadora, un detector y un sistema de adquisición de datos. La fuente de voltaje normalmente es

capaz de proporcionar de 10-30 kV. El capilar posee una longitud entre 50 cm y 1m y posee un diámetro interno muy reducido (menor a 100 m), que facilita la disipación del calor generado por la resistencia eléctrica del electrolito dentro del capilar. Los extremos del capilar están colocados en dos recipientes que contienen una solución del electrolito, el mismo con el que se ha llenado el capilar. Los volúmenes de muestra a analizar son extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nl).