• Author / Uploaded
• Paola Olivos

• Categories
• Correlación y dependencia
• Química
• Matemática
• Ciencia
• Productos químicos

Citation preview

Práctica 9 Detección y cuantificación de nitrógeno fijado por bacterias in vitro 1. Introducción La fijación de nitrógeno es catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa, estrictamente procariótico, compuesto por dos proteínas solubles: la proteína del hierro (dinitrogenasa reductasa o Componente II) y la proteína del MoFe (dinitrogenasa, o Componente I). El MoFe (molibdeno-hierro) es un cofactor esencial en la dinitrogenasa. Algunos fijadores de nitrógeno tienen una dinitrogenasa alternativa que contiene vanadio, en lugar de molibdeno; no obstante, esta clase de dinitrogenasa sólo es sintetizada en ausencia de molibdeno disponible. Las dos enzimas del complejo funcionan conjuntamente: la dinitrogenasa reductasa reduce la dinitrogenasa, mientras que ésta última reduce el nitrógeno (Coyne, 2000; Menesez, 2009). La ecuación para la fijación del nitrógeno es: N2 + 6e- +6H+ + 12ATP + Mg 2+ → 2NH3 + 12ADP + 12 Pi + Mg 2+ Los electrones circulan a través de diversos portadores de electrones y reducen finalmente el nitrógeno: e- → Ferredoxina → Flavodoxina → Proteína del hierro →Proteína del MoFe → N2. Cada electrón transferido requiere dos ATP; sin embargo, la nitrogenasa no es del todo efectiva, y también reduce otros compuestos como el H +, N20, N3 – y el CN-. Por tanto, la ecuación general para la fijación catalizada por la nitrogenasa es: N2 + 8e- +8H+ + 16ATP + Mg 2+ → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi + Mg 2+ La nitrogenasa también cataliza la transformación de sustratos como el acetileno: 2 e- + C2H2 → C2H4 6e- + N2 → 2NH3 Uno de los grandes avances en la investigación de la fijación del nitrógeno tuvo lugar cuando Hardy y sus colaboradores en 1968 introdujeron el ensayo de reducción de acetileno. Anteriormente para probar que un microorganismo fijaba nitrógeno se debía incubar con 15N2 y observar la acumulación de los productos reducidos marcados con 15N, proceso que resultaba caro, debido al costo del 15N y al espectrómetro de masas utilizado en su medición. La prueba de reducción del acetileno (C 2H2) a etileno (C2H4) no sólo es más barata y más rápida, puesto que se puede usar un cromatógrafo de gases, sino que también se puede realizar con una sensibilidad mucho mayor (Coyne, 2000). El procedimiento del ensayo de reducción de acetileno es sencillo y mide indirectamente la fijación de nitrógeno. La muestra: suelo, raíces de las plantas o cultivo celular, es colocada en un contenedor sellado. A continuación, se introduce el acetileno a una concentración suficiente para saturar la nitrogenasa. Por lo general basta 10% de espacio dentro del contenedor para la introducción del gas y se mide periódicamente el etileno generado, extrayendo una muestra de gas del contenedor sellado e inyectándola en un cromatógrafo de gases equipado con un detector y una columna de nitrógeno. El factor de conversión utilizado para transformar los moles de etileno producido (equivalente a los moles de etileno reducido) en los moles de nitrógeno fijado es aproximadamente 3 - 4 :1; 1

sin embargo, varía de 1,5 a 25, por lo que para obtener un valor más exacto se debe recurrir a utilizar 15N u otro isótopo del nitrógeno (Coyne, 2000). Otro método para la medición indirecta del nitrógeno fijado in vitro es el método indirecto de valoración del ión amonio, empleando la técnica colorimétrica de Berthelot o del fenolhipoclorito. Está basado en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta de la reacción del ión amonio (NH 4) con los compuestos fenólicos en presencia de un agente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio u o-fenol y la presencia de un catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo de la reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente, catalizadores y pH alcalino (Lara et al., 2007). Cuando se utiliza fenol o hipoclorito de sodio, la reacción puede ser representada de la siguiente manera: NH3 + 2C6H60-+ 3ClO-

O = C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

2. Objetivos 2.1 Obtener la curva patrón de calibración, la ecuación de la recta y el coeficiente de determinación. 2.2 Detectar y cuantificar el amonio producido por una bacteria fijadora de nitrógeno in vitro. 3. Metodología 3.1 Curva patrón de calibración

a. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH 4Cl Preparar una solución madre de 100 ppm de NH 4CI: Pesar 0,1 g de NH 4CI y disolver en 1 L de agua bidestilada. Posteriormente, con la solución madre o patrón realizar las diluciones (Tabla 1). b. Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría Obtenidas las diluciones, agregar en cada tubo 0,4 mL de solución alcohólica de fenol 10 %; 0,4 mL de nitroprusiato de sodio 0,5 % y 1 mL de solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora. Observar una coloración que varía del verde azulado al azul intenso, en función de la concentración de amonio (Figura 1). Leer la absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro a 632,9 nm. Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de amonio, corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007, construir la curva patrón de calibración (Figura 2), obtener la ecuación de la recta y el coeficiente R 2, que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

2

Tabla 1. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH 4Cl

Solución patrón

H 2 O bidestilada

NH4Cl

[mL]

[mL]

(µg/mL = ppm)

1

0,0

10,0

0

2

0,2

9,8

2

3

0,4

9,6

4

4

0,6

9,4

6

5

0,8

9,2

8

6

1,0

9,0

10

7

1,5

8,5

15

N° de tubo

Figura 1. Diluciones sucesivas de cloruro de amonio más solución alcohólica de fenol, nitroprusiato de sodio y solución oxidante.

Tabla 2. Cuantificación de amonio por colorimetría

N° tubo

NH4 100 (ppm)

Absorbancia

01 02 03 04 05 06

0 2 4 6 8 10

0,058 0,199 0,311 0,480 0,576 0,619

Absorbancia corregida 0,000 0,141 0,253 0,422 0,518 0,561 3

07

15

0,884

0,826

Figura 2. Curva patrón de calibración 1 0.8

f(x) = 0.05x + 0.04 R² = 0.98

0.6 Absorbancia

0.4 0.2 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

NH4 100 ppm

En la ecuación obtenida: y = 0,0544x + 0,0387 Donde: y: representa la absorbancia captada (variable dependiente) x: cantidad de amonio en ppm (variable independiente) Despejar “x” para obtener la cantidad de amonio (ppm) producido por cada bacteria.

x=

y - 0,0387 0,0544

2.1 Detección y cuantificación de amonio Para la cuantificación del nitrógeno fijado in vitro, según el método colorimétrico del fenolhipoclorito descrito por Lara et al. (2007) y Cadena & Martínez (2011), cada bacteria cultivada en agar nutritivo por 24 horas, será inoculada en tubos de 15 x 150mL conteniendo 3mL de caldo extracto de suelo 10% y se incubarán a 30°C, por 72 horas, en agitación constante (150rpm). A continuación, se agregarán 9mL de KCl 2M, se agitarán a 150rpm durante 1 hora y se dejarán en reposo por 1 hora adicional, para después tomar 10mL del sobrenadante y centrifugarlos (2000rpm) durante 3 minutos. Luego, los sobrenadantes se verterán en tubos de dilución y se añadirán 0,4mL de solución alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de solución oxidante. Los tubos se agitarán para mezclar y se dejarán en reposo durante 1 hora adicional. La positividad a la fijación de nitrógeno estará dada por una coloración azul (Figura3) y se leerá la absorbancia en espectrofotómetro de luz visible, a 632,9nm. Las concentraciones se 4

calcularán en la curva patrón, obtenida con diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de cloruro de amonio.

Figura 3. Coloración observada en la cuantificación del nitrógeno fijado como amonio.

4. Referencias bibliográficas Cadena, S., & Martínez, B. (2011). Caracterización de cepas de Pseudomonas spp. y su efecto en la germinación y emergencia de Zea mays L. “maiz” en Lambayeque. (Tesis de Licenciatura). Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Perú. Coyne, M. (2000). Microbiología del Suelo. Un enfoque exploratorio. España: Editorial Paraninfo García, F., & Muñoz, H. (2010). Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo de arroz (Oryza sativa). Tesis de Licenciatura, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque, Perú. Lara, C., Villalba, M., & Oviedo, L. (2007). Bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno en la zona agrícola de San Carlos. Revista Colombiana de Biotecnología, 9(2), 6-14.

5

Menezes, C. (2009). Aislamiento y caracterización de bacterias diazotóficas asociadas a maíz (Zea mays) variedad PAU 871. (Tesis de Licenciatura). Universidad de la República de Uruguay, Uruguay.

5. Anexos a. Caldo extracto de suelo al 10 % (en García & Muñoz, 2010)

Componentes

gL -1

K2HPO4

0,4

MgCl2

0,1

MgSO4.7H2O

0,05

FeCl3

0,01

CaCl2

0,1

Triptona

1,0

Extracto de levadura

1,0

Extracto de suelo al 10 %

250 mL

Agua destilada 750 mL Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz 250 g de suelo agrícola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500 mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25 mL del filtrado y completar a 500 mL con agua destilada.

b. Reactivos (en García & Muñoz, 2010) • Cloruro de potasio 2 M Cloruro de potasio Agua destilada • Solución alcohólica de fenol 10 % Fenol concentrado Alcohol 97º • Nitroprusiato de sodio 0,5 % Nitroprusiato de sodio Agua destilada • Solución oxidante Citrato de sodio Hidróxido de sodio

149,12 g 1000,0 mL 10,0 mL 90,0 mL 0,5 g 100,0 mL 20,0 g 1,0 g 6

Hipoclorito de sodio 5 % o lejía comercial Agua destilada

2,0 mL 100,0 mL

c. Coeficiente de determinación

Ajuste ordinario por mínimos cuadrados. Mientras los puntos no disten mucho de la línea de la regresión, el coeficiente de determinación adoptará valores altos. En estadística, el coeficiente de determinación, denominado R2 y pronunciado R cuadrado, es un estadístico usado en el contexto de un modelo estadístico cuyo principal propósito es predecir futuros resultados o testear una hipótesis. El coeficiente determina la calidad del modelo para replicar los resultados, y la proporción de variación de los resultados que puede explicarse por el modelo.1 Hay varias definiciones diferentes para R2 que son algunas veces equivalentes. Las más comunes se refieren a la regresión lineal. En este caso, el R2 es simplemente el cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson, lo cual es sólo cierto para la regresión lineal simple. Si existe varios resultados para una única variable, es decir, para una X existe una Y, Z... el coeficiente de determinación resulta del cuadrado del coeficiente de determinación múltiple. En ambos casos el R2 adquiere valores entre 0 y 1. Existen casos dentro de la definición computacional de R2 donde este valor puede tomar valores negativos2 . d. Coeficiente de correlación de Pearson

7

Ejemplos de diagramas de dispersión con diferentes valores del coeficiente de correlación (ρ)

En estadística, el coeficiente de correlación de Pearson es una medida de la relación lineal entre dos variables aleatorias cuantitativas. A diferencia de la covarianza, la correlación de Pearson es independiente de la escala de medida de las variables. De manera menos formal, podemos definir el coeficiente de correlación de Pearson como un índice que puede utilizarse para medir el grado de relación de dos variables siempre y cuando ambas sean cuantitativas. El valor del índice de correlación varía en el intervalo [-1,1]: 

 

 

Si r = 1, existe una correlación positiva perfecta. El índice indica una dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando una de ellas aumenta, la otra también lo hace en proporción constante. Si 0 < r < 1, existe una correlación positiva. Si r = 0, no existe relación lineal. Pero esto no necesariamente implica que las variables son independientes: pueden existir todavía relaciones no lineales entre las dos variables. Si -1 < r < 0, existe una correlación negativa. Si r = -1, existe una correlación negativa perfecta. El índice indica una dependencia total entre las dos variables llamada relación inversa: cuando una de ellas aumenta, la otra disminuye en proporción constante.

8