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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Materia: Métodos de Análisis Práctica: Separación de una mezcla de azul de metileno y fluoresceína usando cromatografía por adsorción. Profesor: González Acuña Alumno: Ramírez Gutiérrez Edna Yamile Grupo: 4IM2 Sección: 4

OBJETIVOS  

Separar dos colorantes aplicando una técnica cromatográfica por adsorción. Realizar un perfil de elución para poder comprobar la separación.

FUNDAMENTO Es un método de separación que depende de los equilibrios de adsorción- desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la fase móvil líquida o gaseosa. La fuerza con que es adorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil. En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente es adsorbido. RESULTADOS Tabla 1. A468 Volumen de A493 A468 Volumen de A493 elución elución 3 0.002 0.000 63 0.057 0.038 6 0.048 0.169 66 0.116 0.012 9 0.279 2.013 69 0.517 0.037 12 0.090 0.892 72 1.089 0.076 15 0.033 0.255 75 1.004 0.023 18 0.036 0.107 78 0.633 0.037 21 0.044 0.084 81 0.382 0.037 24 0.042 0.069 84 0.251 0.025 27 0.036 0.047 87 0.212 0.049 30 0.057 0.054 90 0.117 0.005 33 0.040 0.036 93 0.100 0.004 36 0.047 0.046 96 0.096 0.039 39 0.050 0.053 99 0.105 0.038 42 0.049 0.052 102 0.059 0.033 45 0.026 0.032 105 0.014 0.033 48 0.020 0.042 108 0.020 0.011 51 0.020 0.019 111 0.045 0.013 54 0.036 0.022 114 0.044 0.040 57 0.022 0.025 117 0.064 0.037 60 0.030 0.031 120 0.035 0.033

Perfil de elución 2.500

Absorbancia

2.000

1.500

1.000

0.500

0.000 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99102105108111114117120

Volúmen de elución [mL] A493

A668

PREGUNTAS EXTRAS 1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta separación. Fase estacionaria: Alúmina ácida (pH 5) actúa como el adsorbente. Fase móvil: Agua y NaOH (0.1) permite la elución de los solutos a través de la columna de acuerdo con su afinidad por éstos. Soporte: Columna, lugar donde se lleva a cabo la separación de los compuestos. Mezcla: Fluoresceína y azul de metileno, actúan como adsorbato.

2. Defina el término adsorción y empleando fórmulas, esquematice qué fuerzas intermoleculares participan en el proceso de separación de solutos. La adsorción es un fenómeno por el cual átomos, iones o moléculas de gases, líquidos o sólidos disueltos son atrapados o retenidos en una superficie a través de interacciones covalentes (adsorción química) o interacciones débiles: puentes de hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals.

Puentes de hidrógeno: La fuerza por puente de hidrógeno o enlace de hidrógeno es la fuerza eminentemente electrostática atractiva entre un átomo electronegativo y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a otro átomo electronegativo.

Ión- dipolo: los iones de una sustancia pueden interactuar con los polos de las moléculas covalentes polares.

Dipolo- dipolo: La interacción dipolo-dipolo consiste en la atracción electrostática entre el extremo positivo de una molécula polar y el negativo de otra.

Dipolo- dipolo inducido: Tienen lugar entre un ión y una molécula apolar. La proximidad del ión provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula apolar que convierte (de modo transitorio) en una molécula polarizada. En este momento se produce una atracción entre el ión y la molécula polarizada.

3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique qué modificaciones haría para invertir el orden de elución. Se utilizaría alúmina básica y un regulador ácido, de manera que el compuesto retenido sería el azul de metileno por su carga positiva, mientras que la fluoresceína sería el primer compuesto en eluír. DISCUSIÓN Para poder llevar a cabo la separación fue necesario cuidar de varios factores, como mantener la altura de la fase móvil para que de esta manera la presión se mantenga y la velocidad sea constante, así como cuidar el aforo en los tubos donde se recogía la muestra. De esta manera se puede construir un perfil de elución más confiable De acuerdo con el perfil de elución podemos apreciar que la separación de la mezcla de colorantes se llevo a cabo porque existen fracciones con valores de 0 de absorbancia entre los dos picos máximos. Esto quiere decir que una vez terminada la separación de uno de los colorantes, no se obtuvo ninguna señal instrumental hasta después de cierto volumen, que lo da el otro colorante. También de acuerdo con el perfil de elución hay dos picos máximos de absorbancia. El primero corresponde al azul de metileno y se pudo apreciar visualmente mientras se recogían en los tubos. Este compuesto al presentar una carga positiva no interactúa con la fase estacionaria por presentar la misma carga de manera que eluye junto con el agua por la formación de puentes de hidrógeno entre ellos. La fluoresceína por presentar carga negativa queda retenida en la fase estacionara hasta que cambiamos la fase móvil, al agregar el hidróxido comienza una competencia por la fase estacionaria entre la fluoresceína y el hidróxido. Al existir mayor interacción con el NaOH la fluoresceína sale del sistema, representando el segundo pico máximo del perfil de elución. El perfil de elución también nos indica que el azul de metileno muestra señal instrumental en dos longitudes de onda, una máxima en 468 y una en 493, que si bien no es grande, existe señal de absorbancia. Mientras la fluoresceína solo muestra señal a una longitud de 493 nm. Además hay diferencia en lo ancho de las bandas para ambas muestras. La banda del azul de metileno es más estrecha que la de la fluoresceína debido a que eluyó con mayor velocidad. CONCLUSIÓN

   

Se llevo a cabo la separación de los dos colorantes por cromatografía adsorción. Se comprobó la separación debido a las fracciones con valores absorbancia iguales a cero. El azul de metileno muestra señal instrumental en más de una longitud onda. El ancho de banda, es decir la resolución, depende de la velocidad elución.

de de de de

BIBLIOGRAFÍA  

Skoog, D. A., Holler, J. H., Nieman, T. A. “Principios de Análisis Instrumental”, 5a Edición. McGraw Hill. Madrid, España. 2001. (p.p 662-663). Harris, D. (1992) Análisis químico cuantitativo. España: Reverte (p. 105-107).