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• Emi Serrano

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CRISPR/CAS9 INTRODUCCIÓN Las siglas CRISPR/Cas provienen de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, en español “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas.” La segunda palabra, “Cas” es el nombre de una serie de proteínas, como helicasas, polimeras y principalmente nucleasas, a las cuales las llamaron así por CRISPR associated system, es decir: “sistema asociado a CRISPR”.

CRISPR/Cas actúa como un sistema inmune en algunas Bacterias y Arqueas, como por ejemplo, Haloferax mediterranei (arquea), Escherichia coli y Mycobacterium bovis (bacterias). Básicamente, el sistema consiste en secuencias repetidas de DNA espaciadas regularmente dentro del genoma bacteriano que junto con los genes cas codifican para proteínas y mRNAs capaces de reconocer DNA foráneo y clivarlo. El locus CRISPR se encuentra en el genoma de las bacterias y consiste en muchas repeticiones conservadas separadas por espaciadores de distinta longitud. Estos espaciadores pertenecen generalmente a segmentos de DNA de virus o plásmidos.

Además, las secuencias repetidas son, por lo general, palindrómicas, razón por la cual sus transcriptos pueden generar estructuras de horquillas secundarias. Entonces, cuando ingresa un virus a la célula, los mRNAs forman un complejo con la proteína Cas. Si el material genético exógeno interacciona con estos complejos, el DNA será marcado y degradado. Asimismo, las proteínas Cas son capaces de tomar una pequeña parte del ADN viral, modificarlo e integrarlo dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esta manera, si esa bacteria (o su descendencia) se encuentra con ese mismo material genético exógeno, ahora lo inactivará de forma mucho más eficiente y rápida.

Dentro de la ingeniería genética, el sistema CRISPR/Cas9 se utiliza como una herramienta de edición programable que permite generar knockouts, marcado a través a de inserción de genes reporteros, inserciones y deleciones en líneas celulares y animales. La novedad de la técnica es que ofrece amplias aplicaciones en células eucariotas.

DESARROLLO DEL TEMA El proceso de editar un genoma con CRISPR/Cas9 incluye dos etapas. PRIMER ETAPA El ARN guía (gRNA) se asocia con la enzima Cas9. Este ARN guía es específico de una secuencia concreta del ADN, de tal manera que por complementariedad se hibridará en dicha secuencia (la que nos interesa editar o corregir). Entonces actúa Cas9, con su actividad endonucleasa, cortando el ADN. SEGUNDA ETAPA Aquí se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN. El primero llamado indel (inserción-deleción) hace que, después del sitio de corte (la secuencia específica del ADN donde se unió el ARN guía), o aparezca un hueco en la cadena, o se inserte un pedazo más de cadena. Esto conlleva a la pérdida de la función original del segmento de DNA cortado. Un segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para esto, debemos darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el DNA.

El Sistema de edición CRISPR/Cas9 sólo necesita dos componentes:

 ENDONUCLEASA Cas9  gRNA o RNA guía La proteína Cas9 necesita un RNA que usará de guía para realizar el clivaje del DNA. En el sistema bacteriano, la Cas 9 es guiada por crRNA y tracrRNA (trans-activating crRNA) para clivar secuencias específicas. En cambio, en la edición del DNA se utiliza un RNA guía (gRNA) no codificante con una secuencia complementaria a la secuencia target (esta secuencia es

la que queremos editar). El gRNA posee dos componentes moleculares que son combinados en una misma molécula de trancripto:  

RNA específico para la secuencia target (crRNA) RNA trans-activador del crRNA (tracrRNA)

La unidad de gRNA guía a la proteína Cas9 para un locus genómico específico a través del apareamiento de bases entre la secuencia de crRNA y la secuencia target por el extremo 5´ del gRNA. Sobre la unión de la secuencia target, la proteína Cas9 induce un corte de doble cadena específica (DSB). Después del clivaje del DNA, el corte es reparado por la maquinaria de reparación celular a través de la unión de extremos no homóloga (NHEJ) o mecanismos de reparación por homología (HDR).

La nucleasa Cas9 es una proteína recombinante de la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (wt, SpCas9) purificada de E. coli que puede ser utilizada para la edición del genoma con tecnología CRISPR. Esta proteína forma un complejo muy estable de ribonucleoproteína (RNP) con el componente guía de RNA (gRNA). La incorporación de una señal de localización nuclear (NLS) ayuda con la entrada al núcleo, incrementando la tasa de clivaje de ADN genómico.

La secuencia target debe poseer 20 pb de largo y debe estar ubicada inmeditamente upstream a un motivo PAM (motivo protoespaciador adyacente) correspondiente a la secuencia NGG. La secuencia PAM le permite a la Cas9 unirse al DNA y se encuentra sólo en el DNA target, pero no forma parte de target specific CRISPR sequence. El gRNA y el motivo PAM guían a la nucleasa a la secuencia target genómica para formar un complejo y crear un DBS romo tres nucleótidos upstream del sitio PAM.



Knock out de un gen de interés:

Se utiliza el sistema de reparación NHEJ en donde se unen ambos extremos de las cadenas. Cómo es propenso a errores, este sistema puede adicionar o eliminar pocas pares de bases, resultando en un nuevo marco de lectura y/o en una terminación prematura acortando la proteína. 

Knock in dentro del DNA:

Se le une al complejo gRNA/Cas9 una secuencia con homologías y el sistema de Recombinación Homologa lo repara utilizandolo como molde. Este puede tener un promotor, un gen específico con un reportero.

Con respecto a los plásmidos utilizados, cada compañía ofrece sus propios vectores. La compañía OriGene ofrece tres tipos de vectores CRISPR/Cas9 utilizados para edición génica:

Vectores todo en uno: Contienen la expresión tanto del gRNA como de la Cas9. Son los más utilizados, y un ejemplo de ellos es el pCas-Guide. Este vector está diseñado para clonar un inserto de gRNA, y posee el gen de Cas9 óptimamente codificado, dirigido por un promotor CMV (promotor de cytomegalovirus, usado en vectores de expresión en mamíferos para usar con sistemas de gene drive, el cual permite una expresión transitoria fuerte de Cas9). La edición se lleva a cabo al co-transferirse con un DNA donante apropiado. El vector también posee un gen de resistencia a ampicilina para la selección de transformantes en E. coli. OriGene provee el vector precortado, listo para la ligación del inserto. La secuencia target puede ser clonada en el vector gracias a los sitios BamHI y BsmBI que poseen. Respecto al gRNA, el vector contiene un scaffold, es decir, una porción de la secuencia genómica reconstruida compuesta por contigs y gaps, cuyo promotor es el promotor U6. Además posee una etiqueta Myc/DDK, que ayudan a su detección y purificación por afinidad. Otras compañías, como Sigma-Aldrich, utilizan un gen de GFP en el extremo C-terminal para rastrear la transfección, en lugar de la etiqueta Myc/DDK (la fluorescencia GFP aparecerá sólo en células que expresen Cas9).

Vectores T7: Se utilizan principalmente para producción in vitro de gRNA y de mRNA de Cas9. En este sistema, tanto la expresión del gRNA como del mRNA de Cas9 se encuentran bajo el control del promotor T7, por lo que pueden producirse usando el sistema de transcripción in vitro de T7. En el vector pT7-Guide-IVT los sitios BsmSI se utilizan para clonar la secuencia target, y un primer forward del M13 puede utilizarse para secuenciar la secuencia blanco. En el vector pT7-Cas9, la secuencia de Kozak facilita el reconocimiento de la secuencia de inicio durante la traducción. Estos vectores poseen componentes similares a los vistos en los vectores todo en uno.

Nickasa Cas9: Disminuye el corte fuera de rango al requerir la unión independiente de dos gRNA separados a una región genómica localizada, ya que de otra forma cualquier secuencia del genoma que contenga la misma secuencia PAM al final también será cortada (y si está localizada en la parte codificante de un gen, podría inactivarlo). Las nickasas son proteínas Cas9 mutantes que sólo producen el corte en una de las dos hebras de DNA, por lo que para editar los genes se requieren dos gRNAs para guiar a dos Cas9 diferentes. Uno se unirá a la hebra molde, y el otro a la complementaria, produciendo un corte con extremos cohesivos en lugar de extremos romos. En este caso, la reparación por recombinación homóloga es mucho más precisa y da lugar a menos errores. Y su estructura también es similar a la de los vectores todo en uno.

Deseño de los targets del CRISPR

1 Cada empresa vende un kit específico para la síntesis del gRNA.

2

Tranfección de las células con el gRNA y Cas9

3 Hay que corroborar que la deleción o inserción se haya generado en el sitio previsto

diseño del gRNA

4

análisis de la

eficiencia de la edición.

CONCLUSIÓN CRISPR/Cas9 es un método elegido por su alta eficiencia, por sus rápidos resultados y por ser de fácil manejo (en comparación con otros sistemas de edición de genomas eucariotas).

En patologías que implican desórdenes genéticos o factores genéticos de riesgo se recurriría al mecanismo de reparación inducido por Cas9 que permitiría, idealmente, revertir la secuencia patológica en una secuencia WT. En el caso de encontrarse frente a genomas invasivos patogénicos o mutaciones dominantes negativas, se abordaría su tratamiento mediante la disrupción génica a la que puede dar lugar la herramienta. Además de esto, no hay que olvidar que Cas9 puede actuar, con las fusiones pertinentes, como activador o represor transcripcional, algo que permitiría, por ejemplo, reprimir la transcripción de oncogenes y receptores virales en células hospedadoras o, por el contrario, activar transcripcionalmente a los genes supresores de tumores. Todos estos usos, podrían llevar a corregir desregulaciones epigenéticas, controlar los procesos inflamatorios y la autoinmunidad y reprimir la transcripción de genes virales o correceptores virales en tipos celulares vulnerables Se podría implementar, mediante la modificación genómica, en rutas metabólicas de microorganismos para la biotecnología industrial que permitan aumentar el rendimiento de procesos, como pueden ser la producción de combustibles o de biomateriales. También podría ser clave su empleo en sectores como la agricultura o el sector farmacéutico, mejorando rutas de producción o el desarrollo de fármacos. Dentro Ámbito de la investigación biológica, el sistema CRISPR-Cas9 mediante las variadas formas en las que es capaz de modificar el genoma (reparación, knockout, regulación de la expresión), se puede aplicar a estudios de identificación y función de genes silvestres en animales y sistemas celulares modelo, así como a la identificación de mutaciones genéticas o variantes epigenéticas asociadas a alteraciones de funciones biológicas o fenotipos patológicos.

La generación de “off target”, es decir, la obtención de modificaciones en dianas inespecíficas que no forman parte del locus objetivo, es el principal problema de la técnica. Esto se debe a que Cas9, al igual que otras nucleasas, posee el inconveniente de cortar en secuencias del genoma que tengan una secuencia similar a la diana (que porta el gRNA) pero no idéntica.

 Se debe diseñar el RNA guía evitando que éste coincida con más de una secuencia  Un alto contenido en G+C promueve una mejor hibridación. Mientras que un bajo contenido en estas bases o un bucle de desapareamiento en la unión DNA-RNA aumentan los off-target  Una disminución en la concentración del complejo Cas9-gRNA disminuye los off-target aunque también hace que decrezcan los on-target (unión a la diana específica).  El acortamiento del gRNA en su extremo 5’ que trunca la secuencia complementaria en un tamaño de 17 o 18 pares de bases en lugar de 20pb, incrementa su especificidad e inflexibilidad  El uso de nickasas aumenta la eficiencia.  La fusión de nucleasas Fok l, a la Cas9, con sus dominios catalíticos inactivos y sus respectivos RNAs guía (fCas9) obliga a la dimerización para que se produzca el corte entre dos gRNAs separados por entre 15 y 25 pares de bases y con sus PAMs orientados hacia fuera. Es esta dimerización la que otorga a este sistema cuatro veces más especificidad que el empleo de nickasas y una especificidad más de 140 veces mayor que la de Cas9 silvestre

A pesar de que la técnica debe mejorar en cuanto al off target, la vehiculización y la posible respuesta inmune, ya ha habido estudios con resultados exitosos de corrección de mutaciones en ratón tanto in vivo en ratones adultos (Yin et al. 2014) como in vitro en línea germinal (Long et al. 2014) y de eliminación selectiva de las bacterias virulentas de una comunidad mediante fagos portadores de Cas9 que tenían como diana a los genes virulentos de dichas bacterias (Bikard et al. 2014).

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