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• Anthony Joel Carbajal Avalos

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COLORACION DE FORMAS BACTERIANAS Y MATERIAL NUCLEAR I.

INTRODUCCION

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. Por su origen: Colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un auxócromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango de espectro visible. Los auxócromos son grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensificar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados; su función es desplazar a los cromóforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la intensidad. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones: 1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes. 2. Revelan su forma y tamaño. 3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas. 4. Producen reacciones químicas específicas. La diferencia de composición bioquímica de las paredes celulares de las bacterias es responsable de su diferente comportamiento frente a un colorante formado por violeta de genciana y una solución yodurada (coloración Gram). Se distinguen las bacterias grampositivas (que retienen el Gram después de lavarlas con alcohol) y las gramnegativas (que pierden su coloración).

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen) La membrana citoplasmática, situada debajo de la pared, tiene permeabilidad selectiva frente a las sustancias que entran y salen de la bacteria. Es soporte de numerosas enzimas, en particular las respiratorias. Por último, tiene un papel fundamental en la división del núcleo bacteriano. Los mesosomas, repliegues de la membrana, tienen una gran importancia en esta etapa de la vida bacteriana. El núcleoide lleva el material genético de la bacteria; está formado por un único filamento de ácido desoxirribonucleico (ADN) apelotonado y que mide cerca de 1 mm de longitud (1000 veces el tamaño de la bacteria). Las bacterias presentan una amplia variedad de tamaños y formas. La mayoría presentan un tamaño diez veces menor que el de las células eucariotas, es decir, entre 0,5 y 5 μm. Sin embargo, algunas especies como Thiomargarita namibiensis y Epulopiscium fishelsoni llegan a alcanzar los 0,5 mm, En el otro extremo se encuentran bacterias más pequeñas conocidas, entre las que cabe destacar las pertenecientes al género Mycoplasma, las cuales llegan a medir solo 0,3 μm, es decir, tan pequeñas como los virus más grandes. La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo que se conoce como polimorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias: cocos, bacilos y espiroquetas. Esta amplia variedad de formas es determinada en última instancia por la composición de la pared celular y el citoesqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes, unirse a superficies o moverse en presencia de estímulos. En la presente sesión de laboratorio se busca que el estudiante se: 1. Adiestre en el uso de coloración de las estructuras bacterias (pared celular y cromosoma bacteriano) 2. Diferencie la pared celular, membrana celular y el cromosoma bacteriano. II. PROCEDIMIENTOS

COLORACIÓN DE LA PARED CELULAR (Método de Robinow) 2.1.1 Material Biológico: 2.1.2 Material y Equipo de Laboratorio:

2.1.3 Procedimiento 1. Colocar en una lámina portaobjetos una pequeña suspensión de cultivo bacteriano. 2. Con otro portaobjetos, extender suavemente la suspensión tratando de que se obtenga un extendido sumamente fino. 3. Sumergir la preparación en el líquido de Bouin por 1 minuto. 4. Lavar con alcohol y agua para eliminar la coloración amarilla del ácido pícrico. 5. Tratar por 20 minutos con la solución de ácido tánico al 10%. Lavar con agua. 6. Colorear con la solución de cristal violeta por 10 segundos. 7. Lavar y secar a medio ambiente. 8. Observar con objetivo de inmersión. COLORACIÓN DE MATERIAL NUCLEAR (Método de Robinow) 2.2.1 Material Biológico: 2.2.2 Material y Equipo de laboratorio:       

Láminas portaobjetos Tubos de ensayo de 16 x 125 mm Alcohol metílico Alcohol etílico 70º Ácido clorhídrico 1N Colorante Giemsa Solución tampón de fosfatos (pH 7,0)

  

Reactivo de Schaudinn Microscopio Asa bacteriológica

2.2.3 Procedimiento: 1. Colocar en una lámina portaobjetos una suspensión de cultivo bacteriano. 2. Con otra lamina, presionar esta preparación y extender suavemente para lograr un extendido delgado. 3. Sumergir la preparación en metanol por 5 minutos. Escurrir y secar. 4. Sumergir en el reactivo de Schaudinn caliente durante 5 minutos. 5. Conservar en alcohol de 70 º por 30 segundos. 6. Tratar por 10 minutos con HCl 1N a 60°C. Lavar con agua corriente. 7. Sumergir en una solución tamponada del colorante Giemsa y dejar por 30 minutos. Lavar con agua y secar. 8. Observar con objetivo de inmersión.

COLORACIÓN DE MEMBRANA CITOPLASMÁTICA (Método de Robinow) 2.3.1 Material biológico: 

Cultivo de Bacillus licheniformes en agar nutritivo (cultivo de 18 horas).

2.3.2 Material de Laboratorio:       

Láminas portaobjetos Tubos de ensayo de 16 x 125 mm Goteros Éter Solución de Colorante azul victoria al 0.02% Líquido de Bouin Microscopio

2.3.3 Procedimiento: 1. Colocar en una lámina portaobjetos una pequeña suspensión de cultivo bacteriano. 2. Con otro portaobjetos, presionar suavemente el cultivo y extender a fin de obtener un preparado sumamente fino. 3. Someter a la acción de vapores de éter caliente por 5 minutos. 4. Sumergir la preparación en el líquido de Bouin por 10 minutos. 5. Colorear con azul de victoria al 0.02% por 30 segundos. Lavar y secar. 6. Observar con objetivo de inmersión III. RESULTADOS Observar con objetivo de inmersión.

Esquematizar: PARED CELULAR: La superficie de la célula que corresponde a la pared celular se observa de color azul sobre un fondo amarillento. MATERIAL NUCLEAR: El material nuclear se observa de color azul, el citoplasma incoloro y delineado en azul el contorno del bacilo. MEMBRANA CITOPLASMÁTICA: Se observa que la membrana citoplasmática se ha retraído de la pared celular y está coloreada de azul, la pared celular se observa celeste. COLORACIÓN DE LA PARED CELULAR IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Brock, D.; T. Madigan. MICROBIOLOGÍA. 6ta. ed. Edit. Prentice Hall Hispanoamericana, S.A. México D. F, México. 1993. 2. Delgado I. Alberto y cols. LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA. 2da. ed. Edit. McGraw Hill Interamericana, S. A. España 1994. 3. Pelczar, M.; R. Reid y E. Chang. MICROBIOLOGÍA. 4ta ed. Edit. McGraw Hill. México D. F, México. 1982. 4. Stanier, R.; j. Ingraham y M. Wheelis. MICROBIOLOGÍA. 2da ed. Edit. Reverté S.A. Barcelona, España. 1992. V. ANEXOS COMPOSICIÓN DEL LÍQUIDO DE BOUIN   

Solución acuosa saturada de ácido pícrico 75 mL Formalina 25 mL Ácido acético 5 mL

COMPOSICIÓN DEL LÍQUIDO FIJADOR DE SCHAUDINN   

Cloruro mercúrico (solución acuosa saturada) 66 mL Alcohol etílico absoluto 33 mL Ácido acético glacial 1 mL

VI. CUESTIONARIO 1. Explique el fundamento de las técnicas usadas en la práctica.