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Chips de DNA 2007

ChIP-on-Chip ChrIP-Chip ChrIP-DNA microarrays Genome-Wide location analysis 9 Objetivo: Permite analizar in vivo la interacción Proteína-DNA a lo largo del genoma completo de la levadura. 9 Fundamento: el Método combina dos técnicas diferentes - Inmunoprecipitación de cromatina - Hibridación con Chip de DNA

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (ChrIP)

CROSS-LINKING in vivo

LISIS Y FRAGMENTACIÓN DEL DNA POR SONICACIÓN (400-1000 pb)

FUNDAMENTO DEL MÉTODO ChrIP (cont.)

INMUNOPRECIPITACIÓN

NO INMUNOPRECIPITACIÓN

(WCE) (IP) Enriquecido

Chip-ChrIP

Todos los posibles fragmentos del genoma de la levadura

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FUNDAMENTO DEL MÉTODO ChrIP (cont.) Reversión del cross-linking Desproteinización y purificación de DNA

(IP)

(WCE)

AMPLIFICACIÓN POR PCR

IP ELECTROFORESIS DEL PRODUCTO DE PCR

WCE DNA ASOCIADO DNA NO ASOCIADO

CASO REAL DE ChrIP 9SpCENP-A es una variante de la histona H3 específica del centrómero. 9 Para la amplificación por PCR se utilizan 4 diferente parejas de oligos. 9 SpCENP-A está etiquetada con un triple epítopo HA. Takahashi et al. (2000) Science 288, 2215

CARACTERÍSTICAS DEL ChrIP 9 Para poder inmunoprecipitar específicamente la proteína (y al DNA asociado a ella) es necesario: - O bien disponer de anticuerpos específicos frente a la proteína de interés. - O que la proteína objeto de estudio esté etiquetada con HA, Myc, etc (la etiqueta no debe afectar a la función). 9 Solo es posible determinar la posible unión de la proteína a sitios específicos del genoma (determinados por las parejas de Oligos empleados en el PCR).

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ACOPLAMIENTO DEL ChrIP AL ChrIP-Chip 1º- Cross-linking 2º- Fragmentación 3º- Inmunoprecipitación o no Fragmentos de DNA inmunoprecipitados (IP)

Fragmentos de DNA no inmunoprecipitados (WCE)

9 ¿Cómo se consigue amplificar por PCR todos los posibles

fragmentos generados?

Ligation Mediated-PCR Lab. Richard Young, Cambridge Producto de la Sonicación (400 pb) DNA-pol T4 Linker unidireccional (25 y 12 N)

DNA-ligasa PCR utlizando (25 N) el oligo + Cy3 o Cy5

ROUND A/B/C/ RANDOM Lab. Patrick Brown, Stanford Round A:

DNA pol: SEQUENASE Oligo: GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN (N es una mezcla de 60% ATP+TTP y 40% CTP+GTP

Round B:

DNA pol: Taq Oligo: GTTTCCCAGTCACGATC 15 a 35 ciclos de PCR

Round C:

Como el B, pero añadiendo Cy3 o Cy5 al dNTP mix 10 a 25 ciclos de PCR

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ChrIP-Chip 9 DNA del inmunoprecipitado (IP) marcado con Cy5 9 DNA del no inmunoprecipitado (WCE) marcado con Cy3 9Ambas muestras de DNA se juntan y se hibridan con el Chip de DNA (Intergenic-Array)

HIBRIDACIÓN DEL DNA AMPLIFICADO CON EL Chip-DNA 9 Single-array error model: -Eliminar ruido de fondo -Estimar la confianza de la unión (P) (Fig.B: 99,8% de los genes dan la misma señal, con intervalo de error de P=10-3) 9 Relación IP/no-IP se obtiene de tres experimentos independientes Ren et al. (2000) Science 290, 2306

¿Con qué proteínas se puede aplicar el ChrIP-Chip? Con cualquiera que interaccione directa o indirectamente con el DNA 9 Activadores o represores transcripcionales 9 Proteínas implicadas en los orígenes de replicación 9 Proteínas implicadas en la recombinanción 9 Complejos remodeladores de la estructura de la cromatina 9 Factores transcripcionales de iniciación o de elongación 9 Modificaciones específicas de las histonas

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Activadores o represores transcripcionales 9 Laboratorio de R.A. Young

9 Laboratorio de P.O. Brown

http://web.wi.mit.edu/young/location

http://genome-stanford.edu/chromatinip/

- Gal4 - Swi4 Diciembre 2000 - Ste12 - Swi6 - Mbp1 - Mbp1 - Swi4 - Rap1 - Swi6 - Sir2 - Mcm1 - Sir3 - Fkh1 Septiembre 2001 - Sir4 - Fkh2 - Ndd1 - Swi5 - Ace2 - TODOS los conocidos Octubre 2002

Enero 2001

Agosto 2001

Gal4p 9 Proteína activadora de genes necesarios para el metabolismo de la galactosa: -GAL1, GAL2, GAL3, GAL7, GAL10, GAL80 y GCY1 9 Secuencia de unión consenso: CGGN11CCG 9 Chip-DNA: 6361 fragmentos de DNA correspondientes a todas las regiones intergénicas del genoma de la levadura 9 Número de genes en los que coincide: - Unión de Gal4p al promotor (detectada por el ChrIP-Chip) - Activación transcripcional del gen (detectada por Chip)

10 genes

Gal4p

Ren et al. (2000) Science 290, 2306

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CONCLUSIONES CON Gal4p 9 La activación por Gal4p no solo activa los genes

implicados en metabolizar directamente la galactosa 9 También produce otros efectos que, por deducción directa hubiera sido muy difícil imaginar: - Activación de la incorporación de Uracilo (FUR1) - Represión de la glicogénesis (PCL10) - Represión de la incorporación de glucosa (MTH1)

Spo11p 9 HOTSPOTS: regiones de alta frecuencia de recombinación. 9 La mayoría son intergénicas y no intragénicas 9 En ellos se produce rotura de ambas cadenas del DNA (DSB) 9 La formación de DSB requiere Spo11p (proteína relacionada a las topoisomerasas tipo II) 9 Spo11p se une covalentemente, de forma transitoria a los extremos 5’ de los fragmentos de DNA en los DSB (no se usa pues formaldehido) 9 COLDSPOTS: regiones de baja frecuencia de recombinación. 9 Chip-DNA: 6200 ORF’s de levadura Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

Detección de sitios de recombinación Detectan: - 177 cluster HOTSPOTS - 40 cluster COLDSPOTS

En verde “cold spots”, en rojo “hot spots”. Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

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LAS HOTSPOTS CORRELACIONAN CON ALTOS G+C Fig. 5. Correlation of hotspots with peaks of high G + C content on chromosome III. (Upper) A scan of base composition at 1-kb intervals (5-kb sliding window). The marked peaks have a G + C base composition 3% above the average for chromosome III (38.7%). In addition, we show the log values of the median hybridization ratio (DSBenriched probe/total genomic DNA). (Lower) The ORFs (two lines of black rectangles) and the positions of a number of structural chromosomal elements are indicated.

Gerton et al. (2000) PNAS 97, 11383

Novel TRF1/BRF target genes revealed by genomewide analysis of Drosophila Pol III transcription Figure 1 Overview of ChIP-on-chip data analysis. (A) TileHGMM: a statistical framework for the analysis of Chip-on-chip data. (B) Genome-wide colocalization of TRF1/BRF-binding sites. (C) Distribution of TRF1/BRF bound regions across the genome. Number of total TRF/BRF-binding sites per each chromosome is plotted on the graph.

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

Figure 2. Spatial structure of enrichment by TRF1/BRF ChIP. High-resolution detection of TRF1/BRF ChIP By genomic tiling microarrays. Top plot is

the averaged log ratios of ChIP and control binding intensities over two TRF1 replicate experiments, bottom plot is the same for BRF1. Dashed lines mark the predicted peak start and end positions. Brown bars indicate tRNA genes, and light blue bars indicate snmRNA genes.

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

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Figure 3. Classification of TRF1 and BRF occupied regions

Isogai et al. (2007) EMBO J. 26, 76

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