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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA, FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I Integrantes; Luna Olvera Scarlette Muñoz Castro Annel Chincoya Fernando

PRÁCTICA 3. AISLAMIENTO DE CASEÍNA, EFECTO DE LA TEMPERATURA Y FUERZA IÓNICA EN LAS PROTEÍNAS DE SUERO LÁCTEO

¿Se Puede Aislar Caseína De La Leche Por Precipitación?

INTRODUCCIÓN Proteína: Son biomacromoléculas formadas por cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y con un peso molecular mayor o igual a 5000g/mol. Se descubrieron en 1838 y hoy se sabe que son los componentes principales de las células y que suponen más del 50% del peso seco de los animales. El término proteína deriva del griego proteios, que significa primero. CLASIFICACIÓN: Por su composición: a) Simples.- Son aquellas que al hidrolizarse sólo liberan aminoácidos. b) Conjugadas.- Son aquellas que al hidrolizarse liberan aminoácidos y otro compuesto que recibe el nombre de grupo prostético (átomo o molécula). Se subclasifican de acuerdo a su grupo prostético

¿Se puede aislar caseína de la leche por precipitación? FUNDAMENTO 1.

RESULTADOS

Solubilidad de las proteínas

Cuando se agregaron los 200 ml de leche con los 20 ml de ácido acético se logró observar la formación de una pasta en coloración blanquecina con un líquido de color amarillo, la parte de la pasta es la caseína de la leche que había precipitado, mientras que el sobrenadante es el suero de nuestra leche. Nosotros al instante creímos que ambos factores; el aumento de la temperatura y la acidificación en la leche logra romper los enlaces que ésta forma con la caseína. La leche está en gran parte compuesta por un ochenta por ciento de caseína a y a su vez ésta tiene una consistencia blanca, así que al realizar el aumento de temperatura y una acidificación consideramos que fue la razón para poder observar la masa color blanca. Otro punto a considerar es que el punto isoeléctrico de la caseína es es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan (coloquialmente, se dice que coagulan).

Las proteínas en disolución se ven afectadas en su solubilidad por: pH, fuerza iónica, propiedades dieléctricas del disolvente y temperatura. pH: El cambio de pH de la solución en que se encuentra la proteína promueve cambio en las cargas de los residuos, y por tanto un cambio de carga total de la proteína. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico (punto isoeléctrico) y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas. El valor del pH isoeléctrico de una proteína determinada puede variar dependiendo de la cantidad de iones presentes en la solución (aniones o cationes). Cuando se eliminan todos los iones diferentes a H+ o –OH se determina el llamado pH isoiónico y este no varía en la proteína específica.

Al igual que en los tubos de ensayo, que se lograron observar después de someter el tubo al calor o agregarle un ácido, se forman pequeñas partículas de color blanco dispersas en la solución. La acidificación y el calor hicieron menos soluble la proteína y gracias a eso pudimos observarla.

Se pueden separar proteínas usando precipitación por su punto isoeléctrico ya que cada proteína tiene un valor específico. Además, las proteínas presentan su conformación nativa y es posible solubilizarlas en una solución con el pH adecuado

Por su solubilidad: 2. Fuerza Iónica La solubilidad de las proteínas en solución está influenciada por la fuerza iónica que ésta presente, así, a mayor fuerza iónica, menor solubilidad de las proteínas y a menor fuerza iónica, mayor solubilidad de las proteínas.

Por su forma: a) Fibrosas.- Son aquellas que parecen enrollarse a lo largo de un eje común. Generalmente estas proteínas efectúan funciones de sostén, Por ejemplo: Colágeno presente en tejido conjuntivo. b) Globulares.- Son aquellas que presentan plegamientos que les dan apariencia esférica. Generalmente estas proteínas están asociadas a funciones dinámicas, por ejemplo: Hemoglobina, Enzimas, Inmunoglobulinas. Por su función: a) Estructurales.- Por ejemplo las que forman parte de la membrana. b) Reserva.- Por ejemplo Gliadina en el trigo, Albúmina en el huevo. (El hombre no tiene proteínas de reserva).

La explicación física de este comportamiento es compleja, pero al parecer, los iones son capaces de eliminar la capa de hidratación de las proteínas, lo que favorece su interacción y por ello precipitan, a este proceso se le conoce como Precipitación por salado o simplemente Salado.

DISCUSIÓN Como se mencionó antes, la caseína tiene un ph de 4.6. El pH de la leche es aproximadamente de 6.6, la caseína estando a este valor de pH se encuentra cargada negativamente y solubilizada. Si se le añade ácido a la leche la carga negativa de la caseína se neutraliza (los grupos fosfatos se protonan y la proteína neutra se precipita. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína acida por lo que es relativamente hidrofóbica y carece de estructura secundaria y terciaria definida.

3. Temperatura Es necesario considerar que, como cualquier molécula, las proteínas se encuentran en constante movimiento, un aumento en la temperatura hace que este movimiento aumente y por lo tanto la proteína interacciona mejor con el agua manteniéndose soluble.

La solubilidad de las proteínas está influenciada por la fuerza iónica, a mayor fuerza iónica la solubilidad es menor y a menor fuerza iónica mayor solubilidad. los iones son capaces de eliminar la capa de hidratación de las proteínas lo que favorece su precipitación, a este proceso se le conoce como salado y frecuentemente se utiliza para separar proteínas ya que cada proteína tiene diferente grado de hidratación.

El rango de temperatura que permite la solubilización de proteína se encuentra entre 0°C y 40°C. rrompiendo puentes de hidrógeno y fuerzas de van der waals

FICHA DE SEGURIDAD

La mayoría de proteínas a temperaturas mayores sufren desnaturalización debido a la ruptura de puentes de hidrogeno y fuerzas de Van Der Waals, algunas proteínas recobran su conformación al bajar la temperatura a esto se le llama renaturalización. El rango óptimo para trabajar con proteínas es de 20 a 40°C, a mayores temperaturas ciertas proteínas se desnaturalizan a100° C todas las proteínas se desnaturalizan.

c) Hormonas.- Por ejemplo la Insulina d) Catalizadoras.- Son aquellas que aceleran reacciones y reciben el nombre genérico de Enzimas. NIVELES ESTRUCTURALES Las proteínas presentan diferentes estados en su plegamiento hasta alcanzar el de mayor complejidad determinado genéticamente y en éste son capaces de realizar su función biológica; en el esquema se presentan estos niveles estructurales.

Hidróxido de Sodio COMPOSICIÓN

NaOH

PELIGROS

Corrosiva para ojos, piel y tracto respiratorio. Puede producir dermatitis.

MEDIDAS PREVENTIVAS

Si se dispersa alcanza rápidamente una concentración nociva de partículas suspendidas en el aire. Es corrosivo.

COMPOSICIÓN PELIGROS

CH3COOH Inflamable, Por encima de 39°C pueden formarse mezclas explosivas vapor/aire. Riesgo de incendio y explosión en contacto con oxidantes fuertes. Por encima de 39°C, sistema cerrado, ventilación y equipo eléctrico a prueba de explosión.

Este fenómeno se observó con los tubos de ensaye, se utilizó un método físico y uno químico para la alteración en la estructura de la proteína. En uno de los tubos se utilizó una sal con el objetivo de observar un precipitado, llevando a cabo la precipitación por salado, en donde los aniones tienen interacciones con las proteínas del suero y la precipitan, es donde observamos una coloración blanca.

Ácido acético

MEDIDAS PREVENTIVAS

En el segundo tubo se aplicó una temperatura de ebullición, en este no se observó nada, a pesar de encontrarnos en temperaturas altas. Uno de los factores que se especula es la razón de esto, es porque la proteína necesita distinta temperatura para desnaturalizarse o tiene la capacidad para desnaturalizar y renaturalizarse inmediatamente.

Éter Etílico COMPOSICIÓN PELIGROS

MEDIDAS PREVENTIVAS

CH3-CH2-O-CH2-CH3 Inflamable, muy volátil y que puede formar peróxidos explosivos. Las mezclas aire-éter, son explosivamente peligrosas. Por otra parte, al agitar éter anhidro puede generar suficiente electricidad estática como para iniciar un incendio. Manejar la solución en un ambiente ventilado

Alcohol etílico COMPOSICIÓN PELIGROS MEDIDAS PREVENTIVAS

CH3-CH2-OH Falmable, nocivo - irritante y reactivo leves Trabajar el alcohol bajo campana, preferentemente.

Conclusiones Con la práctica experimental se concluye que sí se puede separar la caseína de la leche por precipitación. Primero se conocieron sus características, ésta contiene un punto isoeléctrico 4.6 y debemos llegar a ese ph para modificar a las fuerzas intermoleculares que se están dando en la leche, las disminuimos para poder proseguir con la separación. Al agregar el ácido,, alteramos el medio y acidificamos a mi proteína, alterando sus fuerzas de repulsión y atracción, precipitándola.

Sulfato de amonio COMPOSICIÓN

(NH4)2SO4

PELIGROS

Irritabilidad y disminución de la función pulmonar

MEDIDAS PREVENTIVAS

Principalmente evitar la inhalación o ingesta.

OBJETIVOS 1. 2. 3.

Aplicamos también el factor de temperatura pero no lo estamos controlando en un rango óptico para mantener una velocidad entre los átomos y que tengan más interacción para aumentar la solubilidad. Al contrario, nosotros estamos alterando para romper enlaces y alterar su estrucutura.

Aislar la proteína caseína de leche. Comprobar el efecto de las sales neutras en las proteínas (precipitación por salado). Comprobar el efecto de la temperatura sobre las proteínas.

Debemos tomar en cuenta estos factores si queremos lograr una desnaturalización correcta.

SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS Las proteínas en disolución se ven afectadas en su solubilidad por: pH, fuerza iónica. Propiedades dieléctricas del disolvente, y temperatura. pH El cambio de pH de la solución en que se encuentra la proteína promueve cambio en las cargas de los residuos y por lo tanto un cambio de carga total de la proteína. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico (Punto isoeléctrico) y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas. El valor del pH isoeléctrico de una proteína determinada, puede variar dependiendo de la cantidad de iones presentes en la solución (aniones o cationes). Cuando se eliminan todos los iones diferentes a H+ o –OH se determina el llamado pH isoiónico Fuerza Iónica:La descripción completa de una solución incluye el o los tipos de iones presentes (es decir su carga) y su cantidad, tal descripción se expresa a través del término fuerza iónica ( ) y matemáticamente se define como Temperatura Es necesario considerar que como cualquier molécula, las proteínas se encuentran en constante movimiento, un aumento en la temperatura hace que este movimiento aumente y por lo tanto la proteína interacciona mejor con el agua manteniéndose soluble. El rango de temperatura que permite la solubilización de proteínas se encuentra entre 0.0C y 40.0C. Leche y sus componentes: es una secreción nutritiva de color blanquecino opaco producida por las células secretoras de las glándulas mamarias o mamas de las hembras de los mamíferos. La leche puede contribuir considerablemente a la ingestión necesaria de nutrientes como el calcio, magnesio, selenio, riboflavina, vitamina B12 y ácido pantoténico. Se divide en suero y caseína. La caseína es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados.

MATERIAL Y REACTIVOS

CUESTIONARIO 1.

Material: Matraz Erlenmeyer Agitador Papel filtro 3 tubos de ensaye Baño María Pipeta Embudo 2 vasos de precipitado

Reactivos: Ácido acético Éter etílico Alcohol etílico Sol. Saturada de sulfato de amonio Agua destilada NaOH 50%

¿Cómo es la solubilidad de las proteínas en su PI?

En el punto isoeléctrico la proteína se presenta el mínimo de solubilidad debido a que no existe repulsión electrostática entre las moléculas. 2.

¿Cuál es la explicación física de la precipitación por salado?

Los iones tienen la capacidad de eliminar la capa de hidratación de las proteínas, lo que favorece su interacción y por ello precipitan. La solubilidad de las proteínas está influenciada por la fuerza iónica, a mayor fuerza iónica la solubilidad es menor y a menor fuerza iónica mayor solubilidad. Los iones son capaces de eliminar la capa de hidratación de las proteínas lo que favorece su precipitación, a este proceso se le conoce como salado y frecuentemente se utiliza para separar proteínas ya que cada proteína tiene diferente grado de hidratación.

3.

¿Cómo afecta la temperatura a las proteínas?

La mayoría de las proteínas a temperaturas mayores de 45°C-60°C sufren desnaturalización debido a la ruptura de puentes de hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals.

Bibliografía: Ayudas didácticas de bioquímica Bioquímica de Laguna 6a edición José Laguna y col. Editorial Manual Moderno.