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• José Hitoshi Inoue Velarde

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2014

BIOSEGURIDADA EN EL LABORATORIO

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARRREAL FACULTAD DE INGENIERIA GEOGRAFICA, AMBIENTAL Y ECOTURISMO PROFESORA: Elena Candía TEMA: BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACION Y COLORACION GRAM CICLO: 6° AULA:

TURNO: MA

INTEGRANTES:  

Bautista Baygorrea, Michael Inoue Velarde ,José Hitoshi

RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREVENCIÓN DEL RIESGO EN LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Las prácticas que se realizan en los laboratorios pueden presentar una serie de riesgos de origen y consecuencias muy variadas relacionadas con las propias instalaciones de los laboratorios, con los productos químicos que se manejan y con las operaciones que con ellos se realizan. El objeto de estas recomendaciones que presentamos es que conozcamos estos riesgos y la formade evitarlos, de manera que tengamos presente la prevención desde el primer momento en que iniciemos las prácticas en los laboratorios cumpliendo una serie de normas básicas importantes para su seguridad y salud. 1. HÁBITOS PERSONALES 1. Debemos mantener las batas y los vestidos abrochados, ya que nos van a ofrecer protección frente a salpicaduras y derrames de sustancias químicas. 2. En el laboratorio siempre es recomendable llevar recogidos los cabellos, ya que el pelo largo puedeengancharse en los montajes y equipos y también es más fácil que se contamine con los productosquímicos que vais a utilizar. 3. No se deben dejar objetos personales (abrigos, mochilas, carpetas, etc.) en mesas de trabajo o poyatas, ya que pueden entorpecer las prácticas que vais a realizar y ser la causa de posibles accidentes. 4. No se debe comer ni beber dentro del laboratorio, tampoco es aconsejable mascar chicle mientras serealicen las prácticas, ya que los alimentos o bebidas pueden contaminarse con productos químicos. 5. Está prohibido fumar dentro de los laboratorios, ya que son zonas donde hay bastantes productosquímicos inflamables y por tanto el riesgo de que se produzca un incendio es alto. 6. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas que puedan engancharse en los montajes. 7. Es aconsejable lavarse las manos siempre que se tenga contacto con algún producto químico y antesde salir del laboratorio. 8. Se evitará llevar lentes de contacto, ya que el efecto de los productos químicos es mucho mayor si seintroducen entre la lentilla y la córnea. 9. Para el trabajo habitual dentro del laboratorio deberán llevarse gafas de seguridad normalizadas, ya que protegen los ojos frente a salpicaduras de productos químicos. 10. Las gafas graduadas no protegensuficientemente, existe un tipo especial de gafas protectoras para poner encima de las gafas graduadas. 11. Cuando se trabaja en el laboratorio es aconsejable no llevar: pantalón corto, faldas cortas, sandalias, zapatos abiertos, etc., es decir zonas descubiertas de piel que queden expuestas a posibles salpicadurasde productos químicos. 12. Deben utilizarse guantes cuando se vayan a manipular productos químicos que pueden absorberse a través de la piel.

2. HÁBITOS DE TRABAJO 

Para el desarrollo de las prácticas que vamos a realizar, cada alumno debe tener para su uso personal losmateriales que los profesores le indiquen, además de la bata blanca y las gafas de seguridad.

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Tener en cuenta que siempre, antes de iniciar un experimento en el laboratorio, se debe conocer yanalizar todo su contenido, con el fin de entender el “por qué” de todo lo que se va a realizarposteriormente. Por eso es importante que si alguien no sabe algo, no recuerda algo, o tiene algunaduda, pregunte a su profesor. No deben realizarse experiencias sin la autorización expresa del profesor. El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio porque el orden y la limpieza evitan que seproduzcan accidentes. Los tubos de ensayo no deben llenarse nunca más de dos o tres centímetros, para evitar, si hay queagitarlos o calentarlos, que se produzca derrame del liquido que contienen. Nunca se debe trabajar solo en el laboratorio. Cuando se calienten los tubos de ensayo debe hacerse utilizando pinzas y por la parte más alta a dondellegue el liquido, inclinando el tubo y nunca por el fondo del mismo, ya que de no hacerlo así, el líquidopodría proyectarse por la boca del tubo de ensayo. Debemos tener cuidado de no dirigir la boca del tubo de ensayo hacia nuestra cara ni hacia la de nuestroscompañeros de laboratorio. No deben calentarse líquidos en recipientes de vidrio no resistentes al calor como probetas, matracesaforados, frascos, etc., ya que pueden romperse. Nunca deben llevarse los tubos de ensayo ni los productos químicos en los bolsillos, ya que si se rompeny se derraman pueden producir accidentes. Los productos químicos nunca deben olerse colocando la nariz sobre la boca del recipiente que loscontiene, sino que “se abanicará” con la mano, dirigiendo el vapor suavemente hacia la nariz, de estaforma se evita el que se produzca irritación de las vías respiratorias. No tocar nunca con las manos ni probar los productos químicos. Nunca se deben pipetear con la boca los productos químicos, sino con una pera de goma, porque, deno hacerlo así, se puede producir irritación o quemaduras en la boca. No se debe trabajar alejado de la mesa o poyata, sino siempre sobre ellas, de forma que ofrezcan unapoyo sólido al material que estemos utilizando. Utilizar la vitrina siempre cuando se trabaje con sustancias que desprendan vapores nocivos (tóxicoso irritantes) y cuando se realiza una operación en la que se formen vapores o humos peligrosos. En las cabinas de laboratorio el aire se renueva por medio de un extractor y de esta forma los vaporesnocivos se succionan hacia el exterior del edificio a través del tiro de la vitrina. Cuando haya que diluir un ácido, nunca se añade el agua sobre el ácido, sino al contrario, se añade elácido sobre el agua, poco a poco y con agitación. Si no se hace así, se produce una gran cantidad de calor que puede proyectar el ácido hacia el exteriore incluso romper el recipiente. Al terminar una tarea u operación la mesa debe quedar limpia, los reactivos utilizados ordenados, losequipos desenchufados y las llaves del agua y del gas cerrado. PRACTICA N°02: ESTERILIZACION

La esterilización consiste en la destrucción completa de todos los microorganismos, incluidas las formas resistentes como esporas bacterianas, virus sin envoltura (no lipídicos) y hongos. Se puede dar mediante la esterilización física, química o filtración. De acuerdo a efecto de los esterilizadores tenemos: a) Provocan pérdida de la viabilidad en los microorganismos

a.1. Físicos (calor, radiaciones) a.2. Químicos (óxido de etileno, formaldehído, agentes oxidantes, soluciones antisépticas.) b) Provocan una separación de los microorganismos de la sustancia líquida. b.1. Filtración (se eliminan los microorganismos presentes en un fluido). 1. Esterilización Física 1.1. Calor Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. La efectividad del calor como método de esterilización depende de:  

Temperatura Tiempo de exposición

1.1.1. Calor Húmedo El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: 

El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, proteínas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intermoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.

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El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 °C. Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas. Ventajas     

Rápido calentamiento y penetración Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo No deja residuos tóxicos Hay un bajo deterioro del material expuesto Económico

Desventajas  

No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

1.1.2. Calor Seco El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intermolecular que son más difíciles de romper por el calor seco. La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que la autoclave. La temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren al menos 2 horas de exposición. Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a más de 160°C. Ventajas  

No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas 

Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La incineración se utiliza para destruir material descartable contaminado. La acción directa de la llama elimina a los microorganismos cuando se lleva al rojo el material de metal como ansas, lancetas, agujas de disección. 1.2. Radiaciones Su acción depende de:   

Tipo de radiación Tiempo de exposición Dosis

1.2.1. Ionizantes Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes. 1.2.2. Ultravioletas Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies. 2. Esterilización Química Dentro de los compuestos químicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos. La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan. 

Concentración: varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos.

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Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

PH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentración del agente sobre la célula. El pH determina el grado de disociación y la efectividad del agente químico, pues a menor disociación mayor permeabilidad y mayor efectividad. 2.1. Antisépticos 2.1.1. Alcoholes Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los más utilizados son el etanol e isopropílico. 2.1.2. Iodo

Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, índoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. 2.1.3. Agentes iónicos y anfóteros Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposición de las proteínas y de los fosfolípidos, por lo que se liberan metabolitos desde la célula, se interfiere con el metabolismo energético y el transporte activo. No son esporicidas ni tubercolicidas aún en altas concentraciones. Sus principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tiñen, no son corrosivos de metales, estables, no tóxicos y baratos. Catiónicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram + son más susceptibles. Aniónicos: Jabones y ácidos grasos. Tienen mayor actividad a pH ácido y son eficaces contra Gram +. Anfóteros: Actúan como catiónicos o aniónicos según el pH.

PRACTICA N° 03: COLORACION GRAM Objetivos: 1. Reconocer especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. 2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. Introducción: La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aun retienen el colorante primario. La tinción propuesta por el medico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. Bacteria Gram positiva

Tiene una capa gruesa de peptidoglucano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido lipoteitoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglucano y unido a la membrana citoplasmática. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une solo a la capa de peptidoglucano. El ácido teicoico es el responsable del determinante antígeno del organismo. Bacteria Gram Negativa Tiene una capa delgada de peptidoglucano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacarido. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplasmática y la pared celular hay un espacio periplasmico con enzimas hidroliticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. Materiales e instrumentos - Porta objetos

-Alcohol-acetona

- Hisopo esterilizado

- Safranina

- Mechero bunsen

-Puente de coloración

- Cristal violeta

-Microscopio

-Lugol

-Aceite de inmersión

Procedimiento 1. Con la ayuda de un hisopo esterilizado obtener muestra de bacterias procedentes de la boca y luego extenderla en un porta objetos. Imaginariamente dividir el porta objetos en tres partes y en la parte central de preferencia se extenderá. 2. Fijar la muestra con calor utilizando un mechero bunsen. 3. Añadir 2 gotas de cristal violeta a la preparación hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante un minuto. 4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con agua. 5. Agregar 2 gotas de lugol a la preparación y dejar actuar por un minuto. Transcurrido el tiempo, lavar. 6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante 10 segundos. 7. Añadir el colorante de contraste, safranina (2 gotas) y dejar actuar durante un minuto. Lavar con agua. 8. Dejar secar al aire y observar al microscopio. Enfocar las bacterias, utilizando primero el lente objetivo de 10x. 9. Una vez enfocado a las bacterias, observar con el objetivo de 100x y utilizando una gota de aceite de inmersión. 10. Identificar las bacterias (cocos, diplococos, estreptococos, estafilococos, bacilos, etc.) y graficar lo identificado.