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INNOVACIÓN PARA EL DESARROLLO

Producción industrial de penicilina Un antibiótico es un producto del metabolismo secundario de muchos seres vivos que inhibe el crecimiento de otros organismos o induce la muerte. Son moléculas que actúan sobre las membranas y paredes microbianas, la replicación y la transcripción del DNA, la síntesis de proteínas y, en general, sobre el metabolismo de los microorganismos a diferentes niveles. La observación de Alexander Fleming en 1929 de que los penicillum notatum inhibían el crecimiento de los estafilococos condujo al desarrollo del procese de producción de la penicilina, iniciándose la era de los antibióticos. Las penicilinas son antibióticos del grupo de los betalactámicos empleados profusamente en el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias sensibles. Distintas penicilinas son producidas a partir de Penicillum chrysogeizuin por adición de una apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V.

Hay dos tipos de procesos para la producción microbiología de antibióticos: 1.

El proceso superficial, mediante el cual el microorganismo productor de antibiótico se desarrolla en forma de un almohadilla sobre la superficie de un medio líquido, en bandejas o frascos, o en la superficie de un sustrato solido húmedo finamente fragmentado; por ejemplo, virutas de madera o salvado de trigo. 2. El proceso de inmersión, mediante el cual el microorganismo se desarrolla en un medio líquido mantenido bajo agitación mecánica y aireación continuas, de modo que el microorganismo se desarrolla de manera uniforme y homogénea en la forma de una suspensión de células aisladas o pequeños agregados o colonias en todas áreas del líquido de cultivo.

Producción de penicilina por inmersión El proceso de inmersión acelera en forma notoria el desarrollo y facilita la manipulación de cantidades importantes de microorganismos. Este proceso es mucho más eficiente que los procesos superficiales y, por lo tanto, es el único procedimiento factible para la producción comercial en gran escala.

Etapa I. Preparación de la materia prima Etapa de desarrollo en el laboratorio Normalmente la cepa de producción es mantenida como esporos liofilizados o en nitrógeno líquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo en nitrógeno líquido o congelado a -70 °C. El desarrollo del inóculo se lleva a cabo a 25 °C en agares inclinados y matraces erlenmeyers, para inocular los tanques de sembrado (etapa de proliferación o propagacion) es necesario disponer de un gran número de esporos (conidios). Usando un medio para esporulación (semillas de cereales, afrecho de trigo humedecido, pan integral, etc.) se preparan los conidios de la cepa utilizada. La concentración de esporas (óptima 5x103/ ml) y la formación de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Luego de 6-10 dias los cultivos están bien esporulados y puede inocularse un tanque de sembrado donde los conidios germinan y generan en 1-2 días un micelio activo, suficiente para inocular un fermentador.

Desarrollo en tanques de sembrado El inoculo para el fermentador se obtiene incrementando en forma progresiva la magnitud del crecimiento a través de una serie de tanques de sembrado; se pasa de un tanque a otro trasfiriendo el producto bajo presión de aire a través de cañerías estériles. En general este inoculo masivo equivale a un 5-10% de la partida principal; por lo tanto, los tanques de siembra equivalen a alrededor de 1/10 del volumen del tanque de gran tamaño subsiguiente. La transferencia vegetativa continua del hongo en medios artificiales conduce a una pérdida de la capacidad productora de penicilina (degeneración fisiológica), en consecuencia, es necesario minimizar la cantidad de transferencias intermedias entre el cultivo madre y la partida final.

Medio de cultivo para la fermentación En la fermentación el medio de cultivo es diferente al de proliferación, ya que ahora se trata de favorecer la elaboración del antibiótico por sobre el desarrollo del micelio. Los antibióticos, así como los pigmentos, son metabolitos secundarios. Medio de producción típico Licos de maíz (solidos)……….………..2% a 5% Lactosa bruta……………….………….2% a 3% Carbonato de calcio…………………...0.5% a 1% El medio de cultivo utilizado para la producción comercial de penicilina por lo general contiene material nitrogenado natural, nitrato, ácido α-aminoadípico, harina de semillas de algodón o alcohol de maíz (un producto intermedio de la industria de la molienda del maíz), lactosa, precursor de la cadena lateral, un agente tensioactivo y sales minerales (incluido el sulfuro), también se adicionan compuestos inorgánicos conteniendo hidrogeno, oxigeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, nitrógeno y trazas de hierro, cobre y zinc. Después de ajustar el pH a 4,5-5,0, el medio de cultivo se pasa al fermentador.

Etapa II. Biorreacción Fermentadores Para la fabricación de penicilina se utilizan tanques cerrados estacionarios, conocidos como tanques fermentadores, con una capacidad de 20000 a 115000 litros. La mayoría de estos tanques esta provista de mezcladores a hélice o turbina y un dispositivo mecánico para distribuir aire estéril, el cual se encuentra acoplado en la regio del mezclador para alcanzar un máximo efecto de dispersión. Los tanques tienen una compuerta de acceso desarmable en la parte superior, visores y salidas para líneas de muestreo a válvula y cámaras de alimentación accesorias, lo que la inoculación manual si fuera necesaria (sobre todo en el caso de tanques de sembrado pequeño) y el agregado de otros materiales (estériles), como agentes antiespuma, durante la fermentación. Todas las salidas de los tanques están constantemente expuestas a un chorro de vapor para minimizar el riesgo de contaminación. El medio de cultivo se esteriliza mediante vapor a alta presión con enfriamiento ulterior-. Durante el desarrollo del hongo la temperatura se mantienen automáticamente entre 23°C y 25°C. El aire comprimido introducido en los fermentadores es esterilizado por filtración a través de cartuchos de tamaño adecuado esterilizados al vapor y rellenados, por ejemplo, con lana de vidrio. El aire estéril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitación facilita su uniforme distribución en el seno del líquido.

La fermentación de penicilina es un proceso aeróbico con una velocidad de absorción volumétrica de oxígeno de 0,4-0,8 mM/l min. La aireación presenta un problema especial en esta fermentación, debido a que al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de O2, aumenta también la viscosidad del medio, lo cual crea una resistencia importante para la transferencia de oxígeno. La velocidad de aireación requerida está entre 0,5-1,0 volúmenes de aire (volumen de líquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa debido a que el mismo puede ocasionar una inhibición de la actividad o de la síntesis de enzimas involucradas en la biosíntesis de penicilina. Al cabo de unas 50 a 90 horas el crecimiento se va haciendo más lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado por completo. Condiciones especiales del fermentador Características específicas de penicilina que debe ser considerado cuando se intenta fermentación: • La mayoría de las penicilinas constituyen caldos filamentosos que son pseudoplástico (no Newtoniano) en la naturaleza. Esto significa que pueden ser difíciles de mezclar, debido a su alta (Y no constante) viscosidad. Asimismo, el aumento de la viscosidad del caldo puede obstaculizar la transferencia de oxígeno. Lo que nos lleva al siguiente punto. • La penicilina es un organismo aeróbico, por lo tanto la tasa de suministro de oxígeno es crítico a la fermentación. Así, el reactor debe tener un suministro de oxígeno eficiente sistema. • El pH óptimo para el crecimiento de la penicilina es de 6,5. Así, el reactor debe mantener pH eficientemente (esto se hace con frecuencia mediante la adición de NaOH). • Los problemas de estabilidad de deformación no existen y el mantenimiento de la cepa cuidado es obligatorio. • Duplicación de la biomasa es de aproximadamente 6 horas.

Etapa III. Purificación Actualmente la extracción con solventes es la base para la separación y purificación de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vacío tipo cilíndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 °C con el objeto de disminuir la degradación enzimática y química durante las etapas de extracción posteriores.

Las penicilinas G y V son ácidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas ácidas son solubles en muchos solventes orgánicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extracción se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrífugos en etapas múltiples, a temperaturas de 0 - 3 °C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estáticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversión. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio ácido con una cinética de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recíproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extracción en medio ácido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es más estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilánico (6-APA) la producción de penicilina V es más aconsejable. La extracción de penicilina se puede realizar en una o más etapas sucesivas, con una acidificación del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizándose la extracción y concentración en extractores centrífugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbón para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores críticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentración de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a partir de un solvente se requiere también un exceso de Na + o K+, siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vacío. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente volátil que también separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vacío o calor radiante.

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