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PRACTICA N° 4. OBTENCION DE BIOMASA María Fernanda Suarez Tirado Daniela Pérez Cabrera Natalia Margarita Pinedo Cano Darío Arrieta García UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA, FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA, BIOLOGÍA MOLECULAR. MONTERÍA – CÓRDOBA RESUMEN Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, genero Escherichia. Es una bacteria de flora intestinal humana que puede llegar a ser patógena. Esta práctica de laboratorio se realizó con el propósito de obtener la mayor cantidad de biomasa extraída de un cultivo de E. coli en caldo BHI. Para esto fue necesario separar las células del caldo de cultivo realizado previamente, centrifugando de modo que la biomasa precipitara al fondo del tubo. La biomasa bacteriana de E. coli obtenida, será utilizada posteriormente para la extracción de ADN cromosómico y plasmidial. PALABRAS CLAVE Bacteria, Biomasa, Caldo, Cultivo

ABSTRACT Escherichia coli is a facultative anaerobic, Gram negative bacillus from the Enterobacteriaceae family, Escherichia genus. It is intestinal flora bacterium that can become pathogenic. This laboratory practice was carried out with the purpose of obtaining the largest amount of biomass extracted from E. coli culture in BHI broth. For this it was necessary separate the cells from the previously performed culture broth, by centrifugation, in order to get the biomass precipitated at the bottom of the tube. The bacterial biomass of E. coli obtained, will be used for a chromosomal and plasmidial DNA extraction. Keywords Bacteria, Biomass, Broth, Culture

INTRODUCCIÓN Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, genero Escherichia. Esta bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se le considera un microorganismo de flora normal, pero hay cepas que pueden ser patógenas y causar daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Rodríguez, 2002). Es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano (Analizacalidad, 2015). Esta práctica de laboratorio se realizó con el propósito de obtener la mayor cantidad de biomasa posible extraída de un cultivo de E. coli.

Para el cultivo de microorganismos son necesarios unos requerimientos nutricionales imprescindibles para su crecimiento. Necesitan una fuente de energía, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y agua (Fernández, 2010). Un medio de cultivo, es cualquier “material o sustrato” que proporcione sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos (Castañeda, 2005).

En la actualidad existe una variedad de medios de cultivo, incluyendo los medios líquidos o caldos y los medios solidificados con agar; entre los que podemos encontrar medios enriquecidos, medios selectivos, medios diferenciales y medios especializados (Mühlhauser, 2014). El medio de cultivo utilizado fue el caldo Brain Heart Infusión (BHI), el cual es un medio de cultivo nutritivo tamponado que contiene infusiones de tejido de cerebro y corazón y peptonas para suministrar proteínas y otros nutrientes para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes y no exigentes (BD, 2014).

DISEÑO METODOLÓGICO Materiales 

Centrifuga



Micropipeta de 100-1000 µl



Nevera



Pipetas de 1 y 2 ml



Pera automática



Viales



Tubos Eppendorf



Caja de Petri



Guantes



Tapaboca

Reactivos 

Cepa E. coli



Caldo Brain Heart Infusion (BHI) o Infusión de cerebro y corazón (sólidos)... 6,0 g o Digerido péptico de tejido animal............. 6,0 g o Cloruro sódico.......................................... 5,0 g o Dextrosa.................................................. 3,0 g o Digerido pancreático de gelatina ............ 14,5 g o Fosfato disódico ........................................ 2,5 g

Metodología 1. Prepare caldo BHI con antibióticos (Ampicilina). 2. Tome con el asa bacteriana una pequeña cantidad de colonias E. coli contenidas en la caja de Petri y resuspenda en el tubo de ensayo con el caldo BHI en presencia de un mechero de alcohol. 3. Incube el cultivo por 18-20 horas a 37° C. 4. Añada 1-1,5 ml de cultivo de E. coli en un tubo Eppendorf. 5. Centrifugue la muestra por 3 min a 12000 r.p.m. 6. Descarte el sobrenadante y rellene nuevamente el tubo con 1-1,5 ml de cultivo. 7. Centrifugue la muestra por 3 min a 12000 r.p.m. Este proceso se realiza con el fin de obtener mayor cantidad de biomasa. 8. Guarde a -20° C hasta la próxima utilización.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN E. coli es una bacteria de flora intestinal, es por esto que se desarrolla mejor a temperatura normal corporal de 37°C (Burrill, 2014). Para lograr obtener una buena cantidad de biomasa es necesario permitir una reproducción suficiente del microorganismo, para poder evidenciar señales de crecimiento; esto puede llevar desde algunas horas (18 a 48 hrs. en la mayoría de las bacterias) hasta semanas o meses como sucede en el cultivo de micobacterias y algunos hongos filamentosos (Mühlhauser, 2014). Es por esto que el cultivo fue puesto a incubar un día antes de la práctica.

Fernández (2010) afirma que los medios de cultivo más utilizados suelen ser líquidos como es el caldo de tioglicolato o el caldo cerebro-corazón (BHI) utilizado en esta práctica, ya que en este tipo de medios el crecimiento suele ser mayor porque la disponibilidad de nutrientes es mayor.

Para la obtención de biomasa fue necesario separa las células del caldo de cultivo, eso por esto que se tomó 1,5 ml de cultivo de e. coli y se llevó a las centrifuga de modo que las células (biomasa) se precipitaron al fondo del tubo Eppendorf (Ver Fig. 1) y el líquido sobrenadante (caldo), fue desechado; el proceso se realizó nuevamente para obtener una mayor cantidad de biomasa. Finalmente la muestra de biomasa se guardó a 20° C.

Fig. 1: Biomasa obtenida de cultivo de E. coli

CONCLUSIÓN El caldo de cultivo BHI proporciono un medio nutricional adecuado para un rápido desarrollo de la bacteria E. coli permitiendo obtener cantidad suficiente de biomasa bacteriana, la cual, será utilizada posteriormente para la extracción de ADN cromosómico y plasmidial.

ANEXOS

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

¿Para qué se hace la obtención de biomasa de la bacteria E. coli antes de la extracción de ADN Bacteriano? Este procedimiento realiza con el objetivo de separar las células bacterianas del caldo de cultivo BHI y de esta manera obtener una muestra de biomasa pura no contaminada.

¿Porque se utiliza el caldo BHI para hacer la inoculación del cultivo bacteriano de E. coli y no otro medio de cultivo? Porque El caldo BHI es un medio de cultivo nutritivo tamponado que contiene infusiones de tejido de cerebro y corazón y peptonas para suministrar proteínas y otros nutrientes necesarios para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes y no exigentes. En la fórmula con cloruro de sodio al 6,5%, la sal actúa como agente de diferenciación o selección del tipo de microorganismo que se requiere. BIBLIOGRAFÍA Analizacalidad. (2015). Características más importantes de la Escherichia coli – Cuidamos de los alimentos. Retrieved February 2, 2019, from https://analizacalidad.wordpress.com/2015/01/14/caracteristicas-masimportantes-de-la-escherichia-coli/ BD. (2014). BBL Brain Heart Infusion BBL Brain Heart Infusion with 6.5% Sodium Chloride L007440 • Rev. 12 • Septiembre 2014 PROCEDIMIENTOS DE

CONTROL DE CALIDAD. https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8446

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Burrill, D. (2014). Protocol: DNA Extraction | Method. Retrieved February 2, 2019, from http://www.methodquarterly.com/2014/11/protocol-dna-extractions/ Castane ̃ da Briones, M. T. (2005). Microbiologia ́ aplicada : manual de laboratorio. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Azcapotzalco. Fernández, A., García, C., Saéz, J., & Valdezate, S. (2010). Metodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Retrieved from https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobi ologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf Mühlhauser, M. P., & Lina Rivas, J. (2014). Laboratorio de microbiología: conocimientos básicos para un clínico. Revista Médica Clínica Las Condes, 25(3), 569–579. http://doi.org/10.1016/S0716-8640(14)70072-0 Rodríguez, A. (2002). Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli (Vol. 44). [Secretaría de Salubridad y Asistencia]. Retrieved from http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003636342002000500011