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SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES POR CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Urcia Cerna Juan Manuel 1.-INTRODUCCIÓN La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para la fotosíntesis. La clorofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extracción y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para es estudio y conocimiento de sus propiedades. Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas químicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexión de otras. Constituyen el sustrato fisicoquímico donde se asienta el proceso fotosintético.

2.- OBJETIVOS 

Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de cromatografía en papel.

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Reconocer la vitamina C (ácido ascórbico) mediante azul de metileno.

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Observar el efecto y acción del calor y el cobre sobre la Vitamina C.

3.- FUNDAMENTO TEÓRICO

Cromatografía: “Escribir en colores” Esta técnica de separación de mezcla cualitativa se basa en el principio de retención selectiva, por esto se utiliza en mezclas homogéneas, entre esas líquidolíquido; a su vez la cromatografía también posee diversas técnicas, una de las primeras y más efectiva es la cromatografía en papel, esta técnica es efectiva debido a que la separación se produce al momento en el que una de las sustancias líquidas asciende por un papel poroso, a distintas velocidades por diferencia de solubilidad y velocidad de difusión, conteniendo dos fases representativas, la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil se caracteriza por tener carácter polar, como el metanol y/o etanol. La fase estacionaria se caracteriza por tener carácter no polar, como la remolacha, la espinaca, la zanahoria, el repollo morado y la tinta, entre otros. (Valcárcel Cases-Gómez Hens, 1998)

En la cromatografía, es la fase móvil la cual asciende por el papel poroso para así producir el mayor o menor avance de los componentes de la mezcla, pues cuanto más solubles los componentes de la fase estacionaria, mayor desplazamiento tendrán y entre más anchas sean las marcas mayor abundancia en la mezcla, esto es posible de observar gracias a que normalmente la fase móvil, o los solventes son incoloros. (Valcárcel Cases-Gómez Hens, 1998) (Segundo Gibaja, 1998) Pigmentos vegetales: Los pigmentos se caracterizan por absorber luz y presentar color por el reflejo de ciertos espectros de luz; en los vegetales las hojas, los tallos y las raíces contienen diversos pigmentos entre ellos las quinonas o flavinas (colorante de las flores), pero a pesar de esto son los pigmentos fotosintéticos que absorben la luz solar, esos pigmentos son la clorofila y los carotenoides.(John GilbertStephen Martin,2014).

Estos pigmentos fotosintéticos utilizan la energía solar que absorben en su estructura molecular y cumplen funciones dentro de la célula, la más importante es llevar a cabo la fotosíntesis, es decir, que es fundamental para la existencia de los vegetales. (Plantas medicinales, 2014) La espinaca, que es un vegetal, cuenta con los siguientes pigmentos: 

Clorofila: es el pigmento que lleva a cabo la fotosíntesis, esta absorbe toda la luz exceptuando la de color verde, pues se refleja en el color verde característico de la espinaca. Cuenta con la “clorofila a” y la “clorofila b”, la primera es de color verde azulado y se encarga de la fotosíntesis, mientras la segunda es un pigmento de apoyo.

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Carotenoides: estos se descomponen en el cuerpo humano, al ser consumidos, y se convierten en vitamina A. Se considera esencial para la salud; en las espinacas el pigmento beta carotenoide es el más abundante. Se caracteriza por una coloración naranja presente en las zanahorias.

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Feofitinas: este pigmento se considera un producto de la descomposición, pues pierde un ion de magnesio que permanece en la hoja y esto permite una continua coloración verde en las espinacas.

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Xantofilas: estos pigmentos son carotenoides oxidados, por tanto se produce un cambio en su estructura, se caracterizan por ser de color amarillo. (Plantas medicinales, 2014)

La vitamina c, de la cual son fuente importante las frutas cítricas, vegetales de hoja, papas, tomates, ajïes y kiwis, entre otros. El contenido de ácido L-(+)-ascórbico (AAs) y de ácido deshidroascórbico (DHA)de un alimento es lo que se conoce comosu actividad de vitamina C. La forma oxidada del ácido L-(+)-ascórbico, o ácido deshidroascórbico tiene entreel 75%y 80%de la actividad biológica del primero, pues es rápidamente reducido a AAs en el organismo animal (Cheftel y Cheftel, 1976).

La naturaleza lábil del ácido deshidroascórbico (DHA) sugiere que una vez que el AAsde los alimentos se ha oxidado a este compuesto, el valor del producto como fuente de vitamina C se ha afectado. A menos que esto se tenga en cuenta, la medición conjunta de AAs y DHApuede llevar a conclusiones erróneas si el alimento no va a ser consumido inmediatamente (Smoot y col., 1980).

La degradación del AAsy el pardeamiento que origina se puede producir tanto en presencia como en ausencia de oxigeno (Cheftel y Cheftel, 1976) y por lo tanto, el producto que lo contenga sufrirá con relativa facilidad una disminución en su valor nutritivo durante el procesamiento y almacenamiento y, simultáneamente, una alteración de sus caracteristicas organolépticas como resultado del pardeamiento. Es por esto que la evaluación del contenido de vitamina C constituye un indicador de la calidad del alimento preservado y almacenado, siempre que éste constituya una fuente importante de la vitamina. Los jugos de frutas citricas en especial y de frutilla, tomate, kiwi y ananá, asi como también jugos de frutas enriquecidos adrede, constituyen una fuente excelente de vitamina C para la población, dado el auge en el consumo de este tipo de alimentos. La retención de la actividad vitaminica durante las operaciones de extracción, tratamiento térmico y envasado, asi como durante el posterior almacenamiento, es de primordial importancia en el valor nutricional y calidad organoléptica del producto obtenido, máxime después de haberse comprobado la mejor utilización por el organismo de la vitamina C natural respecto de aquella provista artificialmente (bajo diversas formas farmacéuticas) (Vinson y Bose, 1983).

4.- MATERIALES Y MÉTODOS 

Hojas de Espinaca fresca

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1 piña pequeña

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3 limones

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1 Paquete de gasa

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1 naranjas

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250 ml de alcohol de 96º

Materiales del Laboratorio: 

Mortero

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Embudo

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Matraz

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Papel Filtro

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8 Tubos de ensayo

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4 Vasos de precipitación de 100 ml

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1 Vaso de precipitación de 250 ml

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1 Vaso de precipitación de 600 ml

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Cocina eléctrica

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Tabla de picar

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Cuchillos

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Mortero

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Sulfato de Cobre al 1 %

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Agua destilada

Procedimiento

Para la extracción de pigmentos  Se llevó unas 6 hojas de árbol, luego las hojas se lavó en el lavadero con un poco de chorro de agua.  Una vez que se lavó las hojas se comenzó a retirar los nervios que contenían, seguidamente se fue colocando en un mortero en el cual se le iba a triturar.  Luego de haber quedado solo las hojas sin los nervios se le agrego 5ml aproximadamente de alcohol de 96° en el mortero.  Después de haber triturado las hojas en el mortero con el alcohol y de adicionarle carbonato de calcio aproximadamente unos 10 minutos se procedió a filtrar la solución.  Se colocó una gasa sobre la placa Petri y se procedió a filtrar la solución, una vez filtrado la solución se le coloco un papel filtro para ver los pigmentos que contenía.  Para la betarraga se utilizó un cuchillo en el cual se comenzó a pelar su cascara, una vez que quedó solo la pulpa de la betarraga se procedió con rayar.  Luego de haber rayado toda la pulpa se le añadió unos 5 ml de alcohol y carbonato de calcio y se le dejo reposar por unos cuantos minutos.  Luego se colocó una gasa sobre la placa Petri y se procedió a filtrar la solución, una vez filtrado la solución se le coloco un papel filtro para ver los pigmentos que contenía.

Reconocimiento de la vitamina C  Primero se cortó en 2 partes el limón y la naranja, luego se comenzó a exprimir en unos vasos precipitados para solo obtener solo los zumos.  Luego en un tubo ensayo se le añadió 3 ml del zumo de limón y en otro tubo de ensayo se le añadió 3 ml del zumo de naranja y se le agrego a cada tubo de ensayo 3 gotas de azul de metileno. Acción del calor y el cobre sobre la vitamina C  Primero se rotularon 6 tubos de ensayo, 3 que eran de naranja y los otros 3 que eran de limón seguidamente a cada tubo de ensayo se le añadió 4 ml del zumo.  Luego en el tubo 1 y 2 del limón y el de naranja igual se le añadió con una pipeta 5 gotas de sulfato de cobre al 1% y se le dejo reposar por unos minutos.  Después de dejarlo reposar el tubo 2 del limón y de la naranja se colocó en un vaso precipitado en el cual se le añadió dentro de el aproximadamente 50 ml de agua y se llevó a la cocina por 10 minutos aproximadamente.  Luego para el tubo 3 del limón y de la naranja se le añadió con una pipeta 1 gota de azul de metileno.  Después que transcurrió el tiempo de reposo del tubo 1 del limón y de la naranja se le añadió con una pipeta 1 gota de azul de metileno.  Por ultimo después de haber transcurrido los 10 minutos en la cocina el tubo 2 del limón y de la naranja se le dejo enfriar en un vaso precipitado con agua para que sea mucho más rápido, luego se le añadió con una pipeta 1 gota de azul de metileno.

5.- RESULTADOS Y DISCUSIONES Reconocimiento de los pigmentos de las hojas del árbol

Mediante el proceso de cromatografía de papel como se aprecia en el siguiente dibujo se puede determinar su pigmentación.

Según Müller, (1994) Las xantofilas tienen un color amarillento u ocre, las carotinas son principalmente anaranjadas, la clorofila a es verde azulada y la clorofila b verde amarillenta. -Cuando los cloroplastos pierden parte de su contenido de clorofila predominan los pigmentos amarillentos, causando un cambio de coloración, tal como ocurre durante la maduración de muchos frutos o con las hojas al envejecer, al transformarse los cloroplastos en cromoplastos.

Como indica el autor las xantofilas si contienen un color amarillento u ocre como se logró visualizar en la betarraga y en las hojas de árbol, por otra parte en las hojas de árbol se logró también reconocer su 2 tipos de clorofilas que contenían el a que tiene un color medio verde oscuro mientras que la clorofila b es un poco más claro.

Según la página del colegio maravillas de su práctica nos dice: Debido a la facilidad con que cambia de color el azul de metileno (azul oxidado, blancoreducido) se utiliza comúnmente para la determinación de la vitamina "C", ésta vitamina cede electrones que capta el colorante y se pierde al típico color azul. Como a todas las substancias enzimáticas el calor altera sus propiedades, si además se utiliza conjuntamente el calor y diversos iones metálicos como el cobre o el hierro se pierde incluso su estructura. Si sometemos un tubo de ensayo con zumo de limón hasta la ebullición se destruye la vitamina y dará negativa la prueba con azul de metileno lo cual demuestra que la vitamina se ha destruido.

6.-CONCLUSIONES La temperatura influye en la oxidación y destrucción (dependiendo el tiempo y el incremento) de la vitamina C.

La vitamina C se oxida rápidamente y por eso requiere de cuidados al momento de exponerla al aire, calor y agua. Por tanto cuanto menos calor se aplique, menor será la pérdida de contenido. Las frutas envasadas por haber sido expuestas al calor, ya han perdido gran contenido vitamínico, lo mismo ocurre con los productos deshidratados. En los jugos, la oxidación afecta por exposición prolongada con el aire y por no conservarlos en recipientes oscuro. A mayor transparencia, mayor vitamina C (naranja y limón) y a mayor turbidez menor vitamina C (tomate). Esto se debe a que la vitamina C es oxidada por un oxidante suave como la disolución de yodo para dar lugar a ácido deshidroascórbico y a iones yoduro, este último gracias a la capacidad reductora de la vitamina C. Como pudimos observar en la práctica, nuestro indicador al estar en contacto con los jugos cítricos perdía su coloración, la razón es porque la vitamina C hace que la solución indicadora pierda el color, sin embargo en el tomate tardo un poco más en perder la coloración de nuestro indicador, esto quiere decir que el ácido ascórbico está en menor cantidad.

BIBLIOGRAFIA  Colegio maravilla. Determinación de la vitamina C por el método del dicloroformo- indofenol. Recuperado de: http://www.colegiomaravillas.com/departamentos/biologia/index_htm_files/12vitc.pdf  Cheftel, J.C. y Cheftel, H. 1976. "Introducción a la bioquímica y tecnologia de los alimentos". Vol. I, pág. 291.  Editorial Acribia, Zaragoza, España  Nutrigen service. Vitamina C. recuperado de: http://nutrigenservice.com/vitamina-c/  Valcárcel Cases-Gómez Hens. (1998). Técnicas Analíticas de la Separación  Segundo Gibaja (1998). Pigmentos Naturales Quinónicos.  John Gilbert-Stephen Martin. (2014). Experimental Organic Chemistry.  Plantas medicinales. (2014). Pigmentos Vegetales.  Smooth, J.M. y Nagy, S. 1980. "Effects of Storage Temperature and duration on Total Vitamin C content of canned single-strenght grape fruit juice". J. Agric. and FoodChem. 23(2): 417-421  Vinson, J.A. y Bose, P. 1983. "Comparative bioavailability of synthetic and natural Vitamin C in guinea pigs". Nutrit. Reports Internat. 27(4): 875-880.