UNIVERSIDAD PRIVADA DE TACNA BACILLUS ANTHRACIS INDICE INTRODUCCION 2 OBJETIVOS 3 CAPITULO I: BACTERIAS 3 I. II.
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INDICE INTRODUCCION
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OBJETIVOS
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CAPITULO I: BACTERIAS
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I. II. III. IV. V. VI.
CARACTERISTICAS DE LAS BACTERIAS MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS CULTIVO DE LAS BACTERIAS REPRODUCCION Y DESARROLLO LAS ENZIMAS Y SU REGULACON METABOLISMO BACTERIANO
CAPITULO II: BACILLUS I. II. III.
TAXONOMIA CLASIFICACION ESPECIES
CAPITULO III: BACILLUS ANTHRACIS I. II. III. IV. V. VI.
TAXONOMIA MORFOLOGIA Y FISIOLOGIA ESTRUCTURA ANTIGENA DETERMINANTES DE LA PATOGENICIDAD EFECTOS EN LA SALUD ANTRAX EN EL PERU
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CONCLUSIONES
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ANEXOS
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REFERENCIAS
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INTRODUCCIÓN El género Bacillus está compuesto por bacilos grampositivos grandes caracterizados por su capacidad para producir endosporas. El género incluye microorganismos aerobios estrictos y anaerobios facultativos. Bacillus anthracis es causante de enfermedad en el ser humano. Muchas otras especies están distribuidas en la naturaleza y se hallan en la mayor parte de las muestras de suelos, agua y polvo. Ciertos miembros de dicho género han adquirido importancia como productores de antibióticos. Bacillus anthracis o carbunco (enfermedad de los animales herbívoros, ovinos y bovinos, equinos, porcinos y caprinos) es causado por el B. anthacis. Es un bacilo recto que mide de 3 a 5 micras de largo y de 1 a 1.2 micras de ancho, es inmóvil. Están encapsulados durante la proliferación en el animal infectado. Los microorganismos transmitidos por el aire se controlan mediante técnicas físicas o agentes químicos. El aire simplemente representa un ambiente especial para su aplicación. En las áreas que reciben contaminación doméstica y son ricas en nutrientes orgánicos, predominan las bacterias coliformes, estreptococos fecales, especies de Bacillus, Proteus, Clostridium, y muchas otras. Las bacterias Bacillus , Clostridium y Corynebacterium se agrupan en la familia Bacillaceae, las cuales se caracterizan por presentar células en forma de bastones. Todas las especies producen endosporas. Estas bacterias se encuentran en toda la naturaleza, en el agua, suelo e incluso en el conducto intestinal de animales. La resistencia natural de las esporas que producen les permite sobrevivir largos períodos, cuando son transportadas por el aire. Es por todo lo anterior muy importante saber identificarlos por medio de tinciones de gram, de esporas y de gránulos metacromáticos y así poder determinar cuando son causantes de alguna enfermedad en el humano.
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OBJETIVOS
Llevar a cabo el desarrollo de los microorganismos pertenecientes a las especies Bacillus, Clostridium y Corynebacterium. Reconocer la importancia del cultivo de Bacillus Anthracis
Aprender a realizar la coloración Gram en cultivo de Bacillus Anthracis
Reconocer la estructura antigénica del Bacillus Anthracis y los determinantes de la patogeneidad. Reconocer y analizar los efectos en la salud por causa del Bacillus Anthracis.
CAPITULO I:BACTERIAS
I.
CARACTERISTICAS DE LAS BACTERIAS Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas, barras y hélices. Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, no tienen núcleo ni orgánulos internos. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglucanos. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son móviles. Son los organismos más abundantes del planeta. Son ubicuas, encontrándose en todo hábitat de la tierra, creciendo en el suelo, en manantiales calientes y ácidos, en desechos radioactivos, en las profundidades del mar y de la corteza terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones extremas del espacio exterior. Se estima que hay en torno a 40 millones de células bacterianas en un gramo de tierra y un millón de células bacterianas en un mililitro de agua dulce. En total, se calcula que hay aproximadamente 5×1030 bacterias en el mundo. Las bacterias son imprescindibles para el reciclaje de los elementos, pues muchos pasos importantes de los ciclos biogeoquímicos dependen de éstas. Como ejemplo cabe citar el fijación del nitrógeno
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atmosférico. Sin embargo, solamente la mitad de los filos conocidos de bacterias tienen especies que se pueden cultivar en el laboratorio, por lo que una gran parte (se supone que cerca del 90%) de las especies de bacterias existentes todavía no ha sido descrita. En el cuerpo humano hay aproximadamente diez veces tantas células bacterianas como células humanas, con una gran cantidad de bacterias en la piel y en el tracto digestivo. Aunque el efecto protector del sistema inmune hace que la gran mayoría de estas bacterias sea inofensiva o beneficiosa, algunas bacterias patógenas pueden causar enfermedades infecciosas, incluyendo cólera, sífilis, lepra, tifus, difteria, escarlatina, etc. Las enfermedades bacterianas mortales más comunes son las infecciones respiratorias, con una mortalidad sólo para la tuberculosis de cerca de dos millones de personas al año. En todo el mundo se utilizan antibióticos para tratar las infecciones bacterianas. Los antibióticos son efectivos contra las bacterias ya que inhiben la formación de la pared celular o detienen otros procesos de su ciclo de vida. También se usan extensamente en la agricultura y la ganadería en ausencia de enfermedad, lo que ocasiona que se esté generalizando la resistencia de las bacterias a los antibióticos. En la industria, las bacterias son importantes en procesos tales como el tratamiento de aguas residuales, en la producción de queso, yogur, mantequilla, vinagre, etc, y en la fabricación de medicamentos y de otros productos químicos. Aunque el término bacteria incluía tradicionalmente a todos los procariotas, actualmente la taxonomía y la nomenclatura científica los divide en dos grupos. Estos dominios evolutivos se denominan Bacteria y Archaea. La división se justifica en las grandes diferencias que presentan ambos grupos a nivel bioquímico y en aspectos estructurales. La existencia de microorganismos ya fue hipotetizada a finales de la Edad Media. En el Canon de medicina (1020), Abū Alī ibn Sīnā (Avicenna) planteaba que las secreciones corporales estaban contaminadas por multitud de cuerpos extraños infecciosos antes de que una persona cayera enferma, pero no llegó a identificar a estos cuerpos como la primera causa de las enfermedades. Cuando la Peste Negra (peste bubónica) alcanzó alAndalus en el siglo XIV, Ibn Khatima e Ibn al-Khatib escribieron que las enfermedades 24 infecciosas eran causadas por entidades contagiosas que penetraban en el cuerpo humano. Estas ideas sobre el contagio como causa de algunas enfermedades se volvió muy popular durante el Renacimiento, sobre todo a través de los escritos de Girolamo Fracastoro. Las primeras bacterias fueron observadas por Anton van Leeuwenhoek en 1683 usando un microscopio de lente simple diseñado por él mismo. Inicialmente las denominó animalículos y publicó sus observaciones en una
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serie de cartas que envió a la Royal Society. El nombre de bacteria fue introducido más tarde, en 1828, por Ehrenberg. Deriva del griego y significa bastón pequeño. Louis Pasteur demostró en 1859 que los procesos de fermentación eran causados por el crecimiento de microorganismos, y que dicho crecimiento no era debido a la generación espontánea, como se suponía hasta entonces. (Ni las levaduras, ni los mohos, ni los hongos, organismos normalmente asociados a estos procesos de fermentación, son bacterias). Pasteur, al igual que su contemporáneo y colega Robert Koch, fue uno de los primeros defensores de la teoría germinal de las enfermedades infecciosas. Robert Koch fue pionero en la microbiología médica, trabajando con diferentes enfermedades infecciosas, como el cólera, el ántrax y la tuberculosis. Koch logró probar la teoría germinal de las enfermedades infecciosas tras sus investigaciones en tuberculosis, siendo por ello galardonado con el premio Nobel en Medicina y Fisiología, en el año 1905. Estableció lo que se ha denominado desde entonces los postulados de Koch, mediante los cuales se estandarizaban una serie de criterios experimentales para demostrar si un organismo era o no el causante de una determinada enfermedad. Estos postulados se siguen utilizando hoy en día. Aunque a finales del siglo XIX ya se sabía que las bacterias eran causa de multitud de enfermedades, no existían tratamientos antibacterianos para combatirlas. Fue ya en 1910 cuando Paul Ehrlich desarrolló el primer antibiótico, por medio de unos colorantes capaces de teñir y matar selectivamente a las espiroquetas de la especie Treponema pallidum, la bacteria causante de la sífilis. Erlich recibió el premio Nobel en 1908 por sus trabajos en el campo de la inmunología y por ser pionero en el uso de tintes y colorantes para detectar e identificar bacterias, base fundamental de las posteriores tinción de Gram y tinción de Ziehl Neelsen. Un gran avance en el estudio de las bacterias fue el descubrimiento realizado por Carl Woese en 1977, de que las arqueas presentan una línea evolutiva diferente a la de las bacterias. Esta nueva taxonomía filogenética se basaba en la secuenciación del ARN ribosómico 16S y dividía a los procariotas en dos grupos evolutivos diferentes, en un sistema de tres dominios: Arquea, Bacteria y Eukarya.
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II.
MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS Las bacterias presentan una amplia variedad de tamaños y formas. La mayoría presentan un tamaño diez veces menor que el de las células eucariotas, es decir, entre 0,5 y 5 μm. Sin embargo, algunas especies como Thiomargarita namibiensis y Epulopiscium fishelsoni llegan a alcanzar los 0,5 mm, lo cual las hace visibles al ojo desnudo. En el otro extremo se encuentran bacterias más pequeñas conocidas, entre las que cabe destacar las pertenecientes al género Mycoplasma, las cuales llegan a medir solo 0,3 µm, es decir, tan pequeñas como los virus más grandes. La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo 24 que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias: ● Coco (del griego kókkos, grano): de forma esférica. ○ Diplococo: cocos en grupos de dos. ○ Tetracoco: cocos en grupos de cuatro. ○ Estreptococo: cocos en cadenas. ○ Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo. ● Bacilo (del latín baculus, varilla): en forma de bastoncillo. ● Formas helicoidales: ○ Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, judía o cacahuete. ○ Espirilo: en forma helicoidal rígida o en forma de tirabuzón. ○ Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible). Algunas especies presentan incluso formas tetraédricas o cúbicas. Esta amplia variedad de formas es determinada en última instancia por la composición de la pared celular y el citoesqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para
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adquirir nutrientes, unirse a superficies o moverse en presencia de estímulos. A continuación se citan diferentes especies con diversos patrones de asociación: ● Neisseria gonorrhoeae en forma diploide (por pares). ● Streptococcus en forma de cadenas. ● Staphylococcus en forma de racimos. ● Actinobacteria en forma de filamentos. Dichos filamentos suelen rodearse de una vaina que contiene multitud de células individuales, pudiendo llegar a ramificarse, como el género Nocardia, adquiriendo así el aspecto del micelio de un hongo. Las bacterias presentan la capacidad de anclarse a determinadas superficies y formar un agregado celular en forma de capa denominado biopelícula o biofilme, los cuales pueden tener un grosor que va desde unos pocos micrómetros hasta medio metro. Estas biopelículas pueden congregar diversas especies bacterianas, además de protistas y arqueas, y se caracterizan por formar un conglomerado de células y componentes extracelulares, alcanzando así un nivel mayor de organización o estructura secundaria denominada microcolonia, a través de la cual existen multitud de canales que facilitan la difusión de nutrientes. En ambientes naturales tales como el suelo o la superficie de las plantas, la mayor parte de las bacterias se encuentran ancladas a las superficies en forma de biopelículas. Dichas biopelículas deben ser tenidas en cuenta en las infecciones bacterianas crónicas y en los implantes médicos, ya que las bacterias que forman estas estructuras son mucho más difíciles de erradicar que las bacterias individuales. Por último, cabe destacar un tipo de morfología más compleja aún, observable en algunos microorganismos del grupo de las mixobacterias. Cuando estas bacterias se encuentran en un medio escaso en aminoácidos son capaces de detectar a las células de alrededor, en un proceso conocido como quorum sensing, en el cual todas las células migran hacia las demás y se agregan, dando lugar a cuerpos fructíferos que pueden alcanzar los 0,5 mm de longitud y contener unas 100.000 células. Una vez formada dicha estructura las bacterias son capaces de llevar a cabo diferentes funciones, es decir, se diferencian, alcanzando así un cierto nivel de organización pluricelular. Por ejemplo, entre una y diez células migran a la parte superior del cuerpo fructífero y, una vez allí, se diferencian para dar lugar a un tipo de células latentes
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denominadas cuales son más desecación y, en condiciones adversas.
mixosporas, las resistentes a la general, a ambientales
Las bacterias son organismos relativamente sencillos. Sus dimensiones son muy reducidas, unos 2 μm de ancho por 7-8 μm de longitud en la forma cilíndrica (bacilo) de tamaño medio; aunque son muy frecuentes las especies de 0,5-1,5 μm. Carecen de un núcleo delimitado por una membrana aunque presentan un nucleoide, una estructura elemental que contiene una gran molécula circular de ADN. El citoplasma carece de orgánulos delimitados por membranas y de las formaciones protoplasmáticas propias de las células eucariotas. En el citoplasma se pueden apreciar plásmidos, pequeñas moléculas circulares de ADN que coexisten con el nucleoide, contienen genes y son comúnmente usados por las bacterias en la conjugación. El 24 citoplasma también contiene vacuolas (gránulos que contienen sustancias de reserva) y ribosomas (utilizados en la síntesis de proteínas). Una membrana citoplasmática compuesta de lípidos rodea el citoplasma y, al igual que las células de las plantas, la mayoría posee una pared celular, que en este caso está compuesta por peptidoglicano (mureína). Algunas bacterias, además, presentan una segunda membrana lipídica (membrana externa) rodeando a la pared celular. El espacio comprendido entre la membrana citoplasmática y la pared celular (o la membrana externa si esta existe) se denomina espacio periplásmico. Algunas bacterias presentan una cápsula y otras son capaces de evolucionar a endosporas, estadios latentes capaces de resistir condiciones extremas. Entre las formaciones exteriores propias de la célula bacteriana destacan los flagelos y los pili.
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La membrana citoplasmática de las bacterias es similar a la de plantas y animales, si bien generalmente no presenta colesterol. Tiene una estructura similar a la de plantas y animales. Es una bicapa lipídica compuesta fundamentalmente de fosfolípidos en la que se insertan moléculas de proteínas. En las bacterias realiza numerosas funciones entre las que se incluyen las de barrera osmótica, transporte, biosíntesis, transducción de energía, centro de replicación de ADN y punto de anclaje para los flagelos. A diferencia de las membranas eucarióticas, generalmente no contiene esteroles (son excepciones micoplasmas y algunas proteobacterias), aunque puede contener componentes similares denominados hopanoides. Muchas importantes reacciones bioquímicas que tienen lugar en las células se producen por la existencia de gradientes de concentración a ambos lados de una membrana. Este gradiente crea una diferencia potencial análoga a la de una batería eléctrica y permite a la célula, por ejemplo, el transporte de electrones y la obtención de energía. La ausencia de membranas internas en las bacterias significa que estas reacciones tienen que producirse a través de la propia membrana citoplasmática, entre el citoplasma y el espacio periplásmico. Puesto que las bacterias son procariotas no tienen orgánulos citoplasmáticos delimitados por membranas y por ello presentan pocas estructuras intracelulares. Carecen de núcleo celular, mitocondrias, cloroplastos y de los otros orgánulos presentes en las células eucariotas, tales como el aparato de Golgi y el retículo endoplasmático. Como excepción, algunas bacterias contienen estructuras intracelulares rodeadas por membranas que pueden considerarse primitivos orgánulos. Un ejemplo son los “tilacoides” de las cianobacterias. Las bacterias contienen ribosomas para la síntesis de proteínas, pero éstos son diferentes a los de eucariotas y arqueas. La estructura de los ribosomas de
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arqueas y bacterias es 24 similar, pues ambos son de tipo 70S mientras que los ribosomas eucariotas son de tipo 80S. Sin embargo, la mayoría de las proteínas ribosomiales, factores de traducción y ARNt arqueanos son más parecidos a los eucarióticos que a los bacterianos. Muchas bacterias presentan gránulos intracelulares para el almacenaje de sustancias, como por ejemplo glucógeno, polifosfatos, azufre o polihidroxialcanoatos. Ciertas especies bacterianas fotosintéticas, tales como las cianobacterias, producen vesículas internas de gas que utilizan para regular su flotabilidad y así alcanzar la profundidad con intensidad de luz óptima y/o unos niveles de nutrientes óptimos. Otras estructuras presentes en ciertas especies son los carboxisomas (que contienen enzimas para la fijación de carbono) y los magnetosomas (para la orientación magnética). Las bacterias no tienen un núcleo delimitado por membranas. El material genético está organizado en un único cromosoma situado en el citoplasma, dentro de un cuerpo irregular denominado nucleoide. La mayoría de los cromosomas bacterianos son circulares, si bien existen algunos ejemplos de cromosomas lineales. El nucleoide contiene el cromosoma junto con las proteínas asociadas y ARN. El orden Planctomycetes es una excepción, pues una membrana rodea su nucleoide y tiene varias estructuras celulares delimitadas por membranas. Anteriormente se pensaba que las células procariotas no poseían citoesqueleto, pero desde entonces se han encontrado homólogos bacterianos de las principales proteínas del citoesqueleto de los eucariontes. Estos incluyen las proteínas estructurales FtsZ (que se ensambla en un anillo para mediar durante la división celular bacteriana) y MreB (que determina la anchura de la célula). El citoesqueleto bacteriano desempeña funciones esenciales en la protección, determinación de la forma de la célula bacteriana y en la división celular. Existen dos diferentes tipos de pared celular bacteriana denominadas Gram-positiva y Gram-negativa, respectivamente. Estos nombres provienen de la reacción de la pared celular a la tinción de Gram, un método tradicionalmente empleado para la clasificación de las especies bacterianas. Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular gruesa que contiene numerosas capas de peptidoglicano en las que se inserta ácido teicoico. En cambio, las bacterias Gram-negativas tienen una pared relativamente fina, consistente en unas pocas capas de peptidoglicano, rodeada por una segunda membrana lipídica (la membrana externa) que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas. Los micoplasmas son una excepción, pues carecen de pared celular. La mayoría de las bacterias
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tienen paredes celulares Gram-negativas; solamente son Gram-positivas Firmicutes y Actinobacteria. Estos dos grupos eran antiguamente conocidos como bacterias Gram-positivas de contenido GC bajo y bacterias Grampositivas de contenido GC alto, respectivamente. Estas diferencias en la estructura de la pared celular dan lugar a diferencias en la susceptibilidad antibiótica. Por ejemplo, la vancomicina puede matar solamente a bacterias Gram-positivas y es ineficaz contra patógenos Gramnegativos, tales como Haemophilus influenzae o Pseudomonas aeruginosa. Dentro del filo Actinobacteria cabe hacer una mención especial al género Mycobacterium, el cual, si bien se encuadra dentro de las Gram positivas, no parece serlo desde el punto de vista empírico, ya que su pared no retiene el tinte. Esto se debe a que presentan una pared celular poco común, rica en ácidos micólicos, de carácter hidrófobo y ceroso y bastante gruesa, lo que les confiere una gran resistencia.
III.
CULTIVO DE LAS BACTERIAS Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demográfico de una población. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y será tratada al final de este capítulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por
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bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha población. Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son asincrónicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están creciendo, otras que están iniciando la división celular, etc. En un cultivo sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrónicas. Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismos es en la mayoría de los casos depende de su número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados. iii.1
Cultivo de microorganismos El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.
iii.2
Medios de cultivo Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los
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microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono orgánico. La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Además, en ciertos casos, es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 Esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo. Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales
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cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos), selectivodiferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño. Iii.3
Métodos de aislamiento El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.
iii.4
Concepto de cultivo puro Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para
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poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros. IV.
CRECIMIENTO MICROBIANO iv.1
Crecimiento microbiano en medio líquidos La bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano: iv.1.1 Fase de adaptación Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. iv.1.2 Fase exponencial o logarítmica En ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación. iv.1.3 Fase estacionaria En ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.
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Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales. iv.1.4. Fase de muerte Se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo. iv.2
Crecimiento microbiano en medio sólido Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.
iv.3
Concepto de muerte de un microorganismo Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, no se produce aumento en el número de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y continuar desarrollando una actividad metabólica
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que se traduzca, por ejemplo, en liberación de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables. iv.4.
Crecimiento microbiano equilibrado Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que todos los parámetros del cultivo (biomasa, número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc.) evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio (o en microbiología industrial). Sin embargo, es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos.
V.
REPRODUCCIÓN DE LAS BACTERIAS El crecimiento bacteriano se refiere al incremento ordenado en todos los componentes de una bacteria. Se trata de un proceso de duplicación de las estructuras celulares. En un ambiente favorable, una célula bacteriana aumenta su tamaño (protoplasma) y se reproduce. Existen factores que influyen en el crecimiento y reproducción de las bacterias:* Presencia de sustancias nutritivas en el medio, PH óptimo, T° óptima, presencia o ausencia de O2, etc.* Factores limitantes, factor al cual se debe la interrupción del desarrollo bacteriano* Factores genéticos. v.1
Reproducción por fisión binaria Inicio: la célula se alarga Estrangulamiento en el centro El núcleo se alarga La célula se divide = dos células nuevas con características iguales que la original. forma transversal: amebas forma longitudinal: espirilo. Tipos de reproducción bacteriana (CONJUGACIÓN, TRANSDUCCIÓN, TRANSFORMACIÓN)
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v.1.1 Conjugación Se lleva a cabo si la célula presenta el plásmido F (contiene la información genética para formar pili puentes de unión citoplásmica entre dos bacterias). Célula que presenta el plásmido F+ donadora Célula que no lo contiene Freceptora . La bacteria F+ (donadora de información) se une a una bacteria F- (receptora) mediante uno de sus pili. A través de él introduce una hebra del plásmido F = la bacteria F- se convierte en bacteria F+. F+ (donadora) F- (receptora) F+ En ocasiones el plásmido se introduce en el anillo del ADN bacteriano la bacteria donadora se denomina Hfr (High frequency of recombination). La bacteria Hfr puede donar a otras células cualquier gen de su ADN. v.1.2 Transducción Transferencia de información genética de un donador a un recipiente mediante un bacteriófago. Transducción generalizada Transducción especializada v.1.2.1
Transducción generalizada Cualquier gen bacteriano del donador puede ser transferido para el recipiente. Bacteriófagos degradan el ADN huésped en pequeños pedazos y los empaquetan en la partícula del fago mecanismo ‘head full’ o relleno de la cabeza del fago. *Cualquier gen donador puede ser potencialmente transferido pero solamente en cantidad suficiente para caber en la cabeza de un fago. A) Evento de recombinación en la transducción generalizada Si una célula recipiente es infectada por un fago que contiene ADN donador, el ADN donador entra en la célula recipiente. En el recipiente puede ocurrir un evento de
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recombinación que sustituye el ADN donador y recipiente. v.1.2.2
Transducción especializada Solamente los genes donadores pueden ser transferidos a recipiente. Mediada por fagos lisogénicos o temperados y los genes que son transferidos vendrán a depender de donde él está insertado en el cromosoma.
v.1.3 Transformación Transferencia génica resultante de la captación por una célula recipiente del ADN íntegro de una célula donante. Ciertas bacterias pueden captar ADN del ambiente y el ADN es capturado y puede ser incorporado en el cromosoma de la célula recipiente. a) Etapas de la transformación
Captación de ADN *En bacterias gram positivas el ADN es captado como una molécula de cinta simple y la cinta complementaria es hecha en el recipiente. *Bacterias gram negativas captan ADN de cinta doble. Recombinación legítima/homóloga/general Evento de recombinación recíproca entre el cromosoma y el ADN donante. Esta recombinación requiere homología entre el ADN donante y el cromosoma y resulta en la sustitución del ADN entre el recipiente y el donador.
v.1.4.Formas de involución y porque se forman Involución: Evolución regresiva de alguna especie, órgano, tejido o célula. En cultivos viejos o cuando las bacterias están sometidas a condiciones desfavorables, surgen las llamadas formas de involución: Los cocos se hinchan. Los bacilos se curvan o parecen ramificarse y las estructuras internas desaparecen. v.1.5 importancia
Concepto
de
espora
bacteriana,
su
formación
y
su
La espora bacteriana: estructura que se encuentra metabólicamente latente, y que bajo ciertas condiciones germina y da lugar a una
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célula vegetativa (célula metabólicamente activa). Tipos: Endoespora Exoespora. v.1.5.1 ENDOESPORA Y EXOESPORA Estructura con pared gruesa. Se forma dentro de la célula bacterial. Resistente a agentes químicos y factores físicos extremos. Las exoesporas son esporas externas, éstas son resistentes sólo a calor y desecación y no contienen DPA. FORMACIÓN
ESPORULACIÓN
1. Duplicación del material genético (ADN). 2. Formación del septo de la espora y va aislando el ADN recién replicado junto a una porción de citoplasma. 3. La membrana plasmática rodea el ADN, citoplasma y membrana aislada en paso 2. 4. El septo de la espora rodea la porción aislada formándose la forespora. 5. Se forma una capa de peptidoglicano entre las membranas. 6. La espora se recubre de una cubierta de resistencia. 7. Liberación de la endoespora de la célula al medio VI.
LAS ENZIMAS Y SU REGULACIÓN
ENZIMA Estructura de la triosafosfato isomerasa. Conformación en forma de diagrama de cintas rodeado por el modelo de relleno de espacio de la proteína. Esta proteína es una eficiente enzima involucrada en el proceso de transformación de azúcares en energía en las células. Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible , pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas
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productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La totalidad de reacciones bioquímicas de un organismo constituye su metabolismo, el cual consiste en secuencias de reacciones químicas catalizadas por enzimas llamadas vías metabólicas. En estas secuencias, el producto de una reacción química es el sustrato de la siguiente reacción y así sucesivamente, tal como lo muestra el siguiente esquema. Las vías metabólicas son de dos tipos a) anabólicas: en ellas se sintetizan moléculas básicas que hacen posible construir macromoléculas, son reacciones endergónicas (consumen energía). b) catabólicas: en ellas se rompen moléculas que permiten obtener energía libre utilizable, son reacciones exergónicas (liberan energía). Las células y el organismo, deben regular todas sus vías metabólicas constantemente, esto por la gran necesidad de mantener estables sus condiciones internas, es decir, su homeostasis. En la regulación de la actividad enzimática participan sustancias que actúan como inhibidores, los cuales reducen la velocidad de las reacciones catalizadas. Hay inhibidores naturales que regulan el metabolismo y otrosartificiales que permiten tratar enfermedades o eliminar bacterias patógenas. Los inhibidores se clasifican comoirreversibles y reversibles. Inhibidores irreversibles Son, generalmente, obtenidos por síntesis orgánica y se covalentemente al sitio activo de la enzima y con ello la inactivan.
unen
Un buen ejemplo lo constituye el inhibidor artificial DIPF (dilsopropil fósforofluoridano), que inhibe a la tripsina, enzima pancreática que hidroliza proteínas y a la colinesterasa, enzima que degrada al neurotransmisor acetilcolina en el lecho sináptico, una vez que ésta ha cumplido su función.
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Por esta razón es parte de los gases neurotóxicos, como la sarina, gas utilizado en el metro de Tokio en 1995, que mató a decenas de personas. Inhibidores reversibles Se reconocen dos tipos: 1. Inhibición competitiva 2. Inhibición no competitiva En la inhibición competitiva un sustrato muy parecido al sustrato natural compite con éste por el mismo sitio activo de la enzima. La unión del “impostor” con la enzima no implica formación de nuevos productos, pero impide que esta actúe sobre su sustrato natural. El sustrato “impostor” es desplazado al aumentar la concentración del sustrato natural. En la figura 13 se presenta la inhibición competitiva y como ejemplo la que presenta la enzima succinato deshidrogenasa sometida a una inhibición competitiva por el oxalacetato.
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Figura 13. En la inhibición competitiva, un inhibidor se une temporalmente al sitio activo. La succinato deshidrogenasa, por ejemplo, está sujeta a inhibición competitiva por el oxalacetato. En cambio en la inhibición no competitiva el inhibidor no se une al sitio activo de la enzima, sino que se une a un sitio alejado de este, provocándole un cambio conformacional de manera que el sustrato ya no se adapta. Al igual que en la inhibición competitiva, la enzima se libera del inhibidor y, por ello, es reversible. En la figura 14 se presenta la inhibición no competitiva y como ejemplo la de la enzima treonina deshidratasa por la isoleucina.
Figura 14. Un inhibidor no competitivo se une temporalmente a la enzima en un sitio lejos del sitio activo, pero aún así impide el funcionamiento de la enzima.
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Inhibidores alostéricos Las enzimas alostéricas, por lo general, poseen una estructura de dos o más unidades polipeptídicas y su actividad está controlada por efectores que se unen un sitio alostérico que está separado del sitio activo. Los efectores pueden ser activadores o inhibidores. A continuación se revisará el tipo de regulación alostéricadenominada: inhibición por el producto final. En una vía metabólica, como en el ejemplo de la figura 15, se observa una secuencia de reacciones, cada una de ellas catalizada por una enzima particular.
La primera reacción se denomina “paso obligado”, porque una vez que ocurre, necesariamente seguirán el resto de reacciones de la vía hasta culminar con el producto final. Este “paso obligado” está catalizado por una enzima alostérica. Si la célula tiene suficiente de este producto, ¿cómo frena esta vía? Cuando el producto final está en altas concentraciones actúa como un efector, se une a la enzima alostérica del “paso obligado”, inactivándola. Figura 15. Inhibición de las vías metabólicas. El paso obligado es catalizado por una enzima alostérica que puede ser inhibida por el producto final de la vía. La vía específica que se muestra aquí es la síntesis de isoleucina, un aminoácido, a partir de la treonina. Esta particular serie de reacciones es
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realizada por bacterias, pero es típica de muchas reacciones catalizadas enzimáticamente.
VII. -
METABOLISMO BACTERIANO METABOLISMO: conjunto de reacciones o transformaciones químicas que ocurren en una célula o en un microorganismo. Está constituido por: - ANABOLISMO: conjunto de reacciones químicas encaminadas a la síntesis de componentes celulares. Son reacciones de biosíntesis, que consecuentemente requieren energía. - CATABOLISMO: conjunto de reacciones de degradación de sustancias en las que se produce (o libera) energía. Como resultado de estos dos grupos de reacciones tiene lugar el crecimiento celular. Una célula, para crecer, necesita sintetizar los nutrientes que tienen en el ambiente, y por biosíntesis forma los componentes celulares. Los nutrientes son fuentes de C, N, O. La energía que se necesita para estas biosíntesis, procede del exterior y puede ser de diversa naturaleza: luz, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. La mayoría de los microorganismos usan compuestos químicos orgánicos que son captados del ambiente, introducidos en la célula y degradados por catabolismo en sistemas más simples que la célula necesita (la célula los expulsa, más tarde, como productos de desecho). Esta energía se usa para el anabolismo y para otras funciones celulares, como puede ser el movimiento de los flagelos, transporte de solutos por la membrana. Los microorganismos se puede clasificar atendiendo al tipo de metabolismo que realice. En concreto, se agrupan atendiendo a la fuente de energía que toman del medio o la fuente de C. Dependiendo de la energía que toman del medio para crecer, tenemos: luz, fototrofos - compuestos químicos, quimiotrofos. Estos a su vez se pueden dividir según sea el compuesto químico que utilizan. Ambos obtienen energía de la oxidación del compuesto químico, por tanto, obtienen energía química. inorgánico: quimiolitótrofos - organico: quimioorganótrofos Dependiendo de la fuente de carbono (C) (fuente de moléculas con C para usarlo como constituyente celular), tenemos: - anhidrido carbónico, sintetizan los constituyentes celulares a partir de dióxido de carbono. Transforman compuestos inorgánicos en orgánicos, autotrofos.
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- Utilizan compuestos orgánicos que ya han sido elaborados por otros organismos, heterótrofos. La mayoría de los organismos autótrofos son los que obtienen su energía de la oxidación de compuestos químicos inorgánicos o de la luz. FOTOAUTÓTROFOS: Usan la luz como fuente de energía y el dióxido de carbono como fuente de carbono. Este grupo incluye a: plantas, algas, cianobacterias y bacterias verdes y rojas. LITOAUTÓTROFOS: Usan compuestos químicos inorgánicos como fuente de energía y dióxido de carbono como fuente de carbono. Está formado exclusivamente por procariotas. QUIMIOHETERÓTROFOS: Usan compuestos orgánicos como fuente de energía y fuente de carbono. Son: animales, protozoos, hongos y la mayoría de las bacterias. Estos son los grupos principales (y los microorganismos están presentes en todos) pero también puede haber microorganismos de los siguientes tipos: FOTOHETERÓTROFOS: Usan la luz como fuente de energía y los compuestos orgánicos como fuente de carbono. Pertenecen a este grupo algunas bacterias rojas. MECANISMO DE OBTENCIÓN DE ENERGÍA. Las moléculas poseen enlaces químicos cuya energía puede ser utilizada por microorganismos. La manera de usar esta energía, es mediante reacciones de oxidaciónreducción. Los microorganismos que usan la luz, la transforman en energía química mediante fotosíntesis, por lo que todos los organismos usan energía química. - OXIDACIÓN, consiste en la eliminación de electrones de un átomo o de una sustancia, pero también puede ser la eliminación de átomos de hidrógeno de una sustancia. - REDUCCIÓN, ganancia de un electrón o de un átomo de H. Así, las reacciones redox son la transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno desde una sustancia que se oxida a otra que se reduce. La sustancia que se oxida es el dador de electrones y la que se reduce es el aceptor de electrones. El dador de electrones va a ceder protones al aceptor de electrones en la célula, el dador, que está reducido al transferirse los electrones, se oxida y viceversa. Al dador de electrones también se le denomina fuente de energía o fuente de electrones. Hay un concepto: POTENCIAL REDOX: nos indica la tendencia o facilidad de un compuesto para ceder electrones y oxidarse, o para captar electrones y reducirse.
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CAPITULO II: BACILLUS El género Bacillus está compuesto por bacilos grampositivos grandes caracterizados por capacidad para producir endosporas. El género es amplio e incluye microorganismos aerobios estrictos y anaerobios facultativos. Solo una especie, el Bacillus Anthracis, es causa principal de enfermedad en el ser humano y los otros mamíferos. Muchas otras especies del género están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se hallan en la mayor parte de las muestras de suelo, agua, polvo. Muchas de las propiedades distintivas de los miembros de este género son atribuibles a su necesidad de supervivencia en las condiciones adversas halladas en los diversos hábitats naturales. I.
TAXONOMIA
II.
Dominio : Bacteria Filo : Firmicutes Clase : Bacilli Orden: Bacillales Familia: Bacillaceae
CLASIFICACIÓN
ACIDÓFILAS B. acidocaldarius B. coagulans B. polymyxa
ALCALINÓFILAS B. alkalophilus B. pasteurii
HALÓFILAS B. pantothenticus B. pasteurii
PSICRÓTROFAS B. globisporus B. insolitus B. marinus
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B. macquariensis B. megaterium B. polymyxa
TERMÓFILAS B. acidocaldarius B. schlegelii B. stearothermophilus
DESNITRIFICANTES B. azotoformans B. cereus B. laterosporus B. licheniformis B. pasteurii B. stearothermophilus
FIJADORAS DE NITROGENO B. macerans B. polymyxa
PRODUCTORAS DE ANTIVIÓTICOS B. brevis B. cereus B. circulans B. laterosporus B. licheniformis B. polymyxa B. pumilus B. subtilis
PATÓGENOS DE INSECTOS B. larvae B. lentimorbis B. popilliae B. thuringiensis
PATÓGENOS DE VERTEBRADOS
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B. alvei B. anthracis B. cereus B. coagulans B. laterosporus B. megaterium B. subtilis B. sphaericus B. circulans B. brevis B. licheniformis B. macerans B. pumilus B. thuringiensis III.
ESPECIES Bacillus anthracis Infecciones transmitidas por alimentos, ligada a la ingestión de carne infracocida Bacillus cereus ntoxicación alimentaria , enfermedades asociadas con el almidon, carnes cocidas hortalizas, spas , ensaladas Bacillus lichi formis Alterante de carne cocida (ablandamiento, perdida de color) Bacillus megaterium Coagulacion de la leche evaporada en lata
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CAPITULO III: BACILLUS ANTHRACIS El Bacillus anthracis es una bacteria que forma esporas aeróbicas que producen enfermedad en humanos y animales. Las bacterias se encuentran en dos formas: ántrax cutáneo y ántrax por inhalación. El ántrax cutáneo es una infección de la piel causada por contacto directo con la bacteria. El ántrax respiratorio o por inhalación es una enfermedad infecciosa causada por la inhalación de esporas de la bacteria. I.
TAXONOMIA REINO: FILO: CLASE: ORDEN: FAMILIA: GENERO: ESPECIE:
BACTERIA FIRMICUTES BACILLI BACILLALES BACILLACEAE BACILLUS BACILLUS ANTHRACIS
II. MORFOLOGÍA Y FISIOLOGÍA El Bacillus Anthracis no es exigente, crece en todos los medios ordinarios de laboratorio, crece bien en agar sangre y no es hemolítico. La temperatura óptima de crecimiento es de 37 C y pueden crecer hasta 40 C.
Es anaerobio facultativo. Las condiciones aeróbicas son requeridas para la esporulación. La temperatura óptima de esporulación es de 25 a 37 C, el oxígeno del aire es indispensable y en un medio pobre la favorece
La antigenicidad del Bacillus anthracis se debe a dos grupos de antígenos los antígenos celulares (antígeno capsular y somático) y los componentes de la exotoxina.
Capsula polipéptididos
Espora “No deformante” muy resistente
Gram positivo
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I.1.
Características de su Cultivo
i.2.
Identificación de Laboratorio Materiales:
Desinfectante Hisopos estériles Equipo completo para la toma de hemocultivo Agar sangre Asas bacteriológicas Láminas portaobjetos Coloración de Gram Caldo tripticasa soya (CTS) Agar chocolate suplementado (ACh)
Procedimiento: Con un hisopo prepare el extendido para realizar la coloración de Gram
Con el otro hisopo inocule los medios
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Realice el coprocultivo por el método de rutina y siembre la muestra en ASC, AM y agar fenil etil alcohol. No utilice agar Hecktoen. En algunos casos de meningitis se puede procesar el LCR centrifugado previamente por 1500 g X 15 minutos.
Siembre el sedimento en ASC o en CTS
Realice con el sedimento un extendido y coloree con Gram
Realice el coprocultivo por el método de rutina y siembre la muestra en ASC, AM y agar fenil etil alcohol. No utilice agar Hecktoen. Las muestras deben ser incubadas a 35 a 37ºC en aerobiosis por 18 a 24 horas · Los cultivos deben ser examinados a las 18 – 24 h. Puede ocurrir crecimiento de B. anthracis a las 8h de incubación. Pruebas diferenciales para
i.3.
Resistencia
Las formas vegetativas son destruidas - 600 C en 30 minutos
Forma de esporas - viable para años en el suelo
Autoclave mata las esporas de ántrax
4 % KMnO4 EN 15 mts mata las esporas de ántrax
Susceptible a muchos antibióticos, tales como penicilina, etc.
III. ESTRUCTURA ANTÍGENA
Poseen tres antígenos principales: • Antígeno Capsular: Es un polipéptido de ácido D-glutámico, con una sola especificidad antigénica y con carácter antifagocitario. Puede detectarse en
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los productos patológicos y en medios de cultivo enriquecidos con suero en atmósfera de CO2 en los que da lugar a colonias mucosas. • Antígeno somático: polisacárido, es un componente de la pared celular. Los anticuerpos no son protectores. Reacciona en forma cruzada con la sangre de tipo A y Streptococcus pneumoniae tipo 14. • Toxinas: factor edema y toxina letal.
IV. DETERMINANTES DE LA PATOGENEIDAD
No todas las cepas de B. anthracis son capaces de producir carbunco. Los principales atributos de virulencia de las cepas que producen enfermedad están codificados en dos plásmidos y son: • Toxinas: Produce dos toxinas modelo A-B, que poseen idéntica subunidad B. La subunidad B se conoce como antígeno protector. Es la porción de la toxina que se fija al sitio blanco y permite el ingreso a la célula. – Toxina edema: su subunidad A es el componente enzimáticamente activo; se denomina factor edema. Es una adenilato-ciclasa calmodulinadependiente. Es responsable del importante edema en los sitios de infección, la inhibición de la función de los neutró- filos y obstaculiza la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 6 (IL-6) por parte de los monocitos. – Toxina letal: su porción A, llamada factor letal, es una metaloproteasa que inhibe la señalización transduccional intracelular. Estimula la liberación de TNF e IL-1 por parte de los macrófagos; este mecanismo parece contribuir a la muerte por bacteriemia. • Cápsula: Al igual que sucede con otras bacterias la cápsula es un importante factor de virulencia al inhibir la fagocitosis. V. EFECTOS EN LA SALUD v.1.
Epidemiologia La infección veterinaria tiene una alta tasa de mortalidad por sepsis. En los humanos es una enfermedad actualmente poco frecuente. Dependiendo de la vía de transmisión, produce dos clases de infecciones principales: una cutánea relativamente benigna y una respiratoria que compromete la vida del paciente. La infección cutánea se produce por contacto directo con animales infectados. La
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infección respiratoria requiere la vía inhalatoria, la cual, para ser efectiva, requiere que los ésporos bacterianos sean aerosolizados. Por este motivo, esta vía raramente ocurre de manera natural y despierta la sospecha de intencionalidad (bioterrorismo), aunque se han asociado casos de ántrax inhalatorio con el procesamiento a gran escala de pelos y lana de animales contaminados realizado en espacios pequeños y cerrados. Excepcionalmente se produce una forma gastrointestinal por la ingesta de esporas bacterianas, a partir de carne contaminada. No se transmite de persona a persona.
v.2.
Mecanismo de propagación y transmisión
La transmisión se produce principalmente por cortes, pinchazos, o por contacto directo de la piel lesionada con suelo contaminado con las esporas, o con tejidos, pelo, lana, pieles y productos procedentes de animales infectados (principalmente herbí- voros), tales como cuero o harina de hueso. También puede producirse por la picadura de insectos que se alimentan de la sangre de animales infectados o de sus cadáveres. Otros mecanismos de transmisión son la inhalación de esporas procedentes de productos de animales infectados y la ingesta de carne cruda o poco cocinada contaminada con las esporas. La transmisión de persona a persona es extremadamente rara.
v.3.
Infección Infección Carbunco (pústula maligna, enfermedad de los cardadores de lana, enfermedad de los traperos): infección que se manifiesta de tres formas diferentes: a. Carbunco cutáneo: se caracteriza por la aparición de una lesión en la piel (normalmente en las manos, los antebrazos, el cuello o la cara), que da lugar a una pápula eritematosa y, después, a una vesícula pruriginosa, transformándose posteriormente en una escara oscura, deprimida e indolora que suele estar rodeada por un edema. En la mayoría de los casos la curación es espontánea, mientras que, en los casos más graves, puede producirse la muerte debido a una septicemia. b. Carbunco respiratorio: se produce tras la inhalación de esporas y se caracteriza por síntomas iniciales inespecíficos, como fiebre, disnea, escalofríos, tos seca, cansancio, etc., que pueden evolucionar en pocos días hacia una crisis respiratoria severa acompañada, entre otros, de
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fiebre, disnea, taquicardia, septicemia y/o shock, produciéndose la muerte con gran rapidez. La tasa de mortalidad es muy elevada. c. Carbunco gastrointestinal: se desarrolla tras la ingestión de carne contaminada y se caracteriza por febrícula, náuseas, pérdida de apetito, vómito, seguido por síntomas gastrointestinales severos, como dolor abdominal intenso, hematemesis y diarrea sanguinolenta. En ausencia de un tratamiento apropiado, la muerte puede producirse rápidamente por septicemia. Aunque se ha generalizado el empleo del término “ántrax” debido a su denominación en inglés (“anthrax”), no deben confundirse ambas enfermedades, ya que el ántrax es una infección dérmica producida por estafilococos. v.4.
Patogenia
v.4.1 Eventos después de la entrada a través de una lesión La percepción común es que el Bacillus anthracis no es invasivo y que, excepto cuando se toma por la vía pulmonar, que necesita una lesión a través para entrar en el cuerpo Nuestro conocimiento de los eventos microscópicos siguiente entrada en una lesión proviene principalmente de estudios llevado a cabo hace algunos años en forma parenteral infectados por animales de laboratorio, con un cuadro general de los acontecimientos a partir de la entrada inicial a la muerte como resultado de la acumulada observaciones sobre un número de diferentes especies. Cromartie (1947a) y Bloom (1947) observó que las esporas virulentas inyectan en la piel de los animales susceptibles (ratones, cobayas o conejos) germinó y dio lugar en alrededor de 2-4 horas a una pequeña zona edematosa con adición de encapsulado bacilos. La lesión aumentó de tamaño y se convirtió en definido por una zona de capilares alterados a través de la dilatación, la congestión e hinchazón de las células endoteliales células y diapedesis de los neutrófilos. Los macrófagos y depósitos de fibrina aparecieron y los vasos linfáticos eferentes se convirtieron dilatados. Con la continua multiplicación de los bacilos de la lesión fue la fragmentación del tejido conectivo como la propagación edema ampliamente desde el sitio de inyección. Algunos necrosis y se produjo una hemorragia. Los bacilos eran visibles en focos rodeados de amplias zonas de
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edema aparentemente libre del organismo, y la proliferación en la lesión inicial continuado hasta el punto de la muerte. La fagocitosis era aparentemente mínima. De acuerdo a Sterne (1966), particularmente si la infección ha sido con un pequeño número de esporas, la lesión primaria puede ser insignificante en comparación con la del drenaje ganglio linfático. Los bacilos migran desde la primaria lesión por medio de los vasos linfáticos hasta el local de ganglios linfáticos, donde se produce la multiplicación, la liberación una corriente continua de organismos en el eferente vaso linfático y de allí al bazo y otra los tejidos linfoides, donde la multiplicación continúa Algunas diferencias son evidentes entre las especies: en el cobayo, el terminal de bacteriemia parece que es causada por la multiplicación real en la sangre durante las últimas horas de la vida, mientras que en el ganado, la sangre puede estar libre de organismos tan tarde como 30 minutos antes de la muerte con la misma terminal masiva bacteriemia En tiempos de duplicación durante la final 10-14 horas de bacteriemia son aproximadamente 45 minutos en los ratones, 53 minutos en el cobayo, 95 minutos en ovejas y 115 minutos en ratas En los monos rhesus, el mínimo nivel observable de cerca de 5000 bacilos por ml de la sangre se observó por Klein. (1962) y Lincoln. (1964) 11,5 a 12 horas antes de la muerte, con el septicemia progresar a su nivel de se detectó por primera vez los organismos unas horas antes (17 horas antes de la muerte) en los ganglios desde el conducto linfático torácico En los monos que sucumben a la infección siguiente desafío subcutáneo, los ganglios linfáticos locales se convirtió hemorrágica edematosa y con necrosis de elementos linfáticos y de las paredes de los vasos sanguíneos, y la fagocitosis de los bacilos era evidente aquí. El bazo se despobló de elementos linfoides y contenido extenso de restos celulares necróticosy las masas de bacilos (Gleiser, 1967). en resistentes animales (ratas, perros, cerdos) estudiados por Bloom(1947), B. anthracis germinado y proliferaron como en las especies sensibles para un máximo de alrededor de 4 horas, después de lo cual perdieron sus cápsulas y la proliferación cesado, con las células bacterianas morir, desintegrándose y desapareciendo
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por cerca de 70 horas. Por 26 horas, las lesiones habían sido infiltrada con los neutrófilos y los macrófagos, convirtiéndose en la zona necrótica en un 72 horas. A los 10 días, se inició con la resolución v.4.2 Eventos después de la entrada por inhalación Las diferencias entre especies fueron observados por Gleiser (1967) en estudios de infección en aerosol la comparación de los cerdos y perros, como representante de más hospedantes resistentes, con las ovejas y monos rhesus que representa anfitriones más susceptibles. Las respuestas en la pulmones a la presencia de las esporas se observaron en el pulmones de los cerdos y perros, pero no en las ovejas y monos. Discreta, hemorrágica intensamente y celular lesiones rodeados por densos masas de fibrina en los animales más resistentes fueron interpretados como que representa la capacidad de "aislar" el invasor Se observaron organismos en focos de infección y locales para explicar la falta de infección sistémica. en anteriores estudios en monos rhesus se ha observado que las esporas inhaladas aparentemente no germinaron en los pulmones, pero fueron ingeridas por los macrófagos móviles que les lleva a través del epitelio intacto a los vasos linfáticos La germinación se inició en el camino de ida o en destino en el traqueo bronquial ganglios linfáticos, y el vegetativo Las células liberadas de los fagocitos entonces proliferaron (Ross, 1957). La infección que se contagia a través de la conducto linfático eferente en el torrente sanguíneo. Algunos de las bacterias han llegado a los ganglios linfáticos peri bronquial dentro de los 15 minutos de la inhalación de las esporas. Liquidación de los pulmones era aparentemente ineficaz, sin embargo; Henderson (1956) encontró que, en monos rhesus expuestos a aerosol esporas de ántrax, pero protegido de contraer por la penicilina combinada y la profilaxis de la vacuna, 15% -20%, 2% y 0,5% -1% de las esporas se mantuvo en los pulmones a los 42, 50 y 75 días respectivamente después de la exposición, e incluso después de 100 días niveles de trazas de esporas estaban presentes. Esto fue confirmado por Friedlander (1993) en un estudio similar en el que la última muerte
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ántrax se produjo el día 58 en un grupo de monos rhesus expuestos al ántrax en aerosol esporas y mantenido en doxiciclina durante 30 días después de la exposición. En las fases terminales en monos infectados vía respiratoria, los ganglios linfáticos y intra torácicas bazo mostró cambios similares a los observados en los ganglios linfáticos locales de los animales infectados por vía subcutánea v.4.3
Eventos después de la entrada por ingestión
En el ganado vacuno y ovino, las lesiones intestinales son focales de difundir la enteritis necrótica hemorrágica del intestino delgado. La tendencia de las lesiones localizadas a desarrollar en las placas de Peyer sugiere un posible papel de la célula M en la captación de la bacilo del ántrax (Hutyra et al, 1946;. Jensen, 1974). En un estudio de infección experimental en ganado vacuno, la lesión primaria en 18 de los 19 novillos fue un edematosa y el área hemorrágica en el intestino delgado, 4-6 pulgadas (10-15 cm) de largo y situado a unos 16 pies (aproximadamente 5 m) desde el píloro. La hemorragia y la edema demarcada claramente la lesión desde contigua intestino (Jackson et al., 1957). En los cerdos, la faringe ántrax resultados de la penetración de los bacilos a través del epitelio superficial que recubre la amígdalas o de la amígdala fosas Los registros de la patología ántrax en el hogar animales son notablemente desprovisto de las descripciones de la lesión para lesiones pre-existentes en la patogénesis de la enfermedad, de nuevo se plantea la cuestión de la invariable la necesidad de lesiones pre-existentes en la patogénesis de la enfermedad v.4.4 Factores de virulencia En la primera mitad del siglo 20, se sostuvo quede muertos por ántrax era debido a un fallo circulatorio de la obstrucción capilar, hipoxia y el agotamiento de nutrientes por parte de las muy grandes cantidades de bacilos. Este mecanismo fue sugerido por el microscopio electrónico aparición de capilares dilatados rellenos con bacilos. Con el microscopio electrónico, sin embargo, Se observaron los bacilos que ser simplemente atrapado dentro fibrina y trombos de leucocitos y, posteriormente, se demostró que la muerte se debió a una.
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Dictamen ahora ha circundado de nuevo a favoreciendo la hipoxia como la causa última de la muerte, aunque con la toxina inducida líder colapso vascular a este. El complejo de toxina y la cápsula son los dos conocidos factores de virulencia de B. anthracis. Ambos son mediados por plásmidos. Los genes para los componentes de la toxina y el regulador de genes de virulencia Atxa se encuentran en una grande (182 kb) del plásmido pXO1 designado y los genes para la síntesis de la cápsula y la degradación y sus reguladores ACPA y ACPB se encuentran en una más pequeña (95 kb) plásmido, pXO2 El gen ATXA, originalmente llamado así por su control de los genes de la toxina ántrax, es también el regulador maestro de la biosíntesis de la cápsula operón de genes a través de un efecto positivo en la transcripción de ACPA y ACPB. Así, hay comunicación entre los dos plásmidos y algunos interdependencia entre los dos factores de virulencia. Tanto la toxina y la expresión de la cápsula se modulan por el CO2 o iones bicarbonato y, en cepas de curado pXO1, aumentando el CO2 nivel aumentará la expresión de ACPA y ACPB y con ello aliviar la necesidad para ATXA
v.5.
Prevención v.5.1 Desinfectantes Formaldehido o glutaraldehido al 2%, formalina al 5% (se recomienda inmersión durante toda la noche), hidróxido sódico al 10%, hipoclorito sódico. v.5.2 Inactivación física Inactivación de las células vegetativas con calor a 121ºC durante al menos 30 minutos e inactivación de las esporas con calor a más de 140ºC durante varias horas y por radiación gamma. v.5.3 Antimicrobianos
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Penicilina (excepto en caso de inhalación), ciprofloxacino, doxiciclina, tetraciclinas, eritromicina, estreptomicina, cloranfenicol, claritromicina, clindamicina, vancomicina y rifampicina. v.5.4 Vacunación La vacuna sólo se recomienda a trabajadores con alto riesgo de exposición, como personal de las fuerzas armadas, investigadores de laboratorio o personas que trabajen con animales infectados o sus cadáveres (p.e. trabajadores de mataderos). v.5.5 Medidas preventivas generales Control sanitario de los animales y sacrificio del ganado infectado. Destrucción de los cadáveres de animales infectados, a ser posible, mediante incineración. Mantener los locales en condiciones adecuadas de ventilación, limpieza y desinfección. Control de vectores (insectos, roedores). Seguir unas correctas prácticas de higiene en el trabajo: aseo personal, prohibición de comer en zonas de riesgo, evitar la exposición de heridas abiertas cubriéndolas con apósitos impermeables. Utilización de ropa de trabajo y equipos de protección individual adecuados. En hospitales o centros sanitarios, adoptar las Precauciones Estándar. v.5.6 EPI Protección respiratoria: máscaras con filtro P2 o P3 para operaciones en las que se generen aerosoles de animales infectados. Protección de las manos: guantes (incluidas las mangas) impermeables, cuando sea inevitable el contacto directo con animales o materiales infecciosos. Protección ocular: pantalla facial en caso de manipulación de tejidos animales en la que se puedan originar proyecciones o salpicaduras.
iv.6.
Tratamiento
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El tratamiento se debe realizar con antibióticos, desde los comienzos tempranos de la enfermedad. Históricamente la penicilina ha sido el tratamiento de elección para el ántrax y esta ha sido aprobada por la Administración de Drogas en los Estados Unidos. También la doxiciclina, de la clase de las tetraciclinas, ha sido aprobada. Los datos in vitro sugieren que algunas fluoroquinolonas, especialmente el ciprofloxacin, tienen una eficacia equivalente en el tratamiento del ántrax . VI.
ANTRAX EN EL PERÚ En relación a los aspectos de ántrax o carbunco, queremos señalar que en nuestro país en la década de los 80 se reportaba 400 casos al año básicamente en áreas rurales (agrícolas) de Ayacucho, Cajamarca, Huancavelica, Arequipa, Ica y Lima. Estos cuadros básicamente eran lesiones de ántrax cutáneo (pústula maligna) y excepcionalmente se complicaban con lesión meníngea (con 75% de letalidad). Luego de iniciar un programa de vacunación animal, sólo tenemos ahora 20 a 40 casos al año reportados en todo el país. Estos casos habitualmente son adquiridos por manipulación del ganado vacuno, muerto por ántrax. Ántrax digestivo: Los hombres de campo, habitualmente, incineran las vísceras (hígado, bazo) intestinos que están negros por las hemorragias. Este faenamiento se hace para "salvar" la carne que luego se comercializa en forma clandestina y produce lesiones cutáneas ("pústulas malignas"). La ingestión de esta carne no produce ántrax gastrointestinal al ser humano, pues la cocción destruye tanto las formas vegetativas como las esporas, pero sí produce lesiones cutáneas como pústulas. Se adjuntan 6 fotos de diferentes pacientes para mostrar las formas cutáneas que hemos visto. Las 2 últimas corresponden a pacientes vistos este año durante el Gorgas 2001 (febrero-marzo) Para comparación, se adjuntan fotos de loxoce-lismo pues es el gran diagnóstico clínico diferencial. La lesión cutánea por ántrax es una lesión vesicular que rápidamente adquiere aspecto de una úlcera de fondo negruzco. Se acompaña de un edema redondeado que envuelve la lesión negra y es como un
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rodete; en este edema hay pequeñas vesículas como perlas. Esta lesión no es dolorosa, pero luego aparece el edema de partes blandas y, especialmente, ganglios "satélites" que sí son muy dolorosos, al igual que el edema periférico. El diagnóstico diferencial más importante es con la mordedura de araña (loxoscelismo) que se inicia como una lesión pálida equimótica que rápidamente se torna púrpura. Tiene bordes irregulares, maldefinidos, no tiene rodete alrededor de la lesión y es una lesión dolorosa, se acompaña de flictenas sero-hemáticas (se adjuntan fotos 7, 8 y 9). El uso de esporas de ántrax, como parte de bioterrorismo, nos pone en esta perspectiva siendo la más grave lesión, la ganglionar mediastínica, de curso grave y de alta letalidad. No tenemos aún un patrón radio-lógico característico a excepción de aumento importante de ganglios me-diastínicos; mediastinitis hemorrágica o pericarditis hemorrágica. No tenemos experiencia clínica en estas formas.
Foto 1.Carbunco cutáneo.
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Foto 2. Carbunco cutáneo.
Foto 3. Carbunco cutáneo.
Foto 4. Carbunco cutáneo.
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Foto 5. Carbunco cutáneo.
Foto 6. Carbunco cutáneo.
Foto 7. Loxoscelismo cutáneo, principal lesión confundible con carbunco cutáneo.
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Foto 8. Loxoscelismo cutáneo
Foto 9. Loxoscelismo cutáneo en etapa más avanzada.
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CONCLUSIONES
Los Bacillus son bacilos G(+), pueden ser o no esporulados, móviles o invóviles. Desarrollan en forma de estreptobacilos con terminaciones redondeadas. Pueden presentar gránulos metacromáticos o endoesporas. El género Corynebacterium presenta gránulos metacromáticos, se pueden observar en forma de L o V, empalizadas, cuerpo de maso. Pueden ser o no capsulados, móviles o inmóviles y no esporulados. El género Clostridium es un bacilo que se observa como embarazado, pueden ser móviles o inmóviles, capsulados o no capsulados, esporulados. Es un anaerobio estricto. Se debe tener una extrema precaución al realizar el proceso de cultivo Eliminar por completo posibles focos de reproducción de la bacteria El bacillus anthracis puede causar una grave infección ya que se manifiesta de tres formas diferentes. Como también puede tener efectos muy toxicos. No se transmite de persona a persona.
ANEXOS
Figura 1. Bacillus anthracis en cultivo morfología.
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Figura 2. Bacillus anthracis en el pulmón en un caso de sepsis.
Figura 3. Bacillus anthracis en tejido, tinción de Gram/Wiegert. Gentileza de Pfizer; Reproducido de: Infectious Diseases, text and color atlas. W E Farror, M J Wood, J A Innes, H Tubbs Second ed, 1996. Mosby, London, England.
Figura 4. Carbunco. Lesión del antebrazo (escara).
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Figura 5. Pústula maligna.
Figura 6. Carbunco lesión del cuello en un trabajador que cargaba pieles.
Figura 7. Carbunco. Lesión necrótica (escara) en la espalda.
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Figura 8. Carbunco faial (Gentileza colección Hospital Lucio Córdova L.)
Figura 9.Carbunco en antebrazo izquierdo (Gentileza colección Hospital Lucio Córdova L.)
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Figura 10.Carbunco antebrazo derecho (Gentileza colección Hospital Lucio Córdova L.)
Figura 11. Ántrax cutáneo al ingreso. Observe la escara central y anillo vesiculoso en rededor, edema cervical y facial. (Gentileza de Pfizer).
Figura 12.El mismo paciente 8 días más tarde. La escara se extendió y el edema perilesional se ha reducido significativamente. (Gentileza de Pfizer).
Figura 13. Carbunco facial en párpado inferior, con extenso edema perilesional. (Gentileza de Pfizer). FUENTE: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182001000400010
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REFERENCIAS http://www.monografias.com/trabajos90/principales-especies-generobacillus/principales-especies-genero-bacillus.shtml#patologiaa https://biologialiga.files.wordpress.com/2008/08/bacteria2010.pdf https://www.cdc.gov/anthrax/es/images/anthrax-book-spanish-update-finalhighres.pdf SANTIAGO, A. (2012). CONJUGACIÓN BACTERIANA, TRANSDUCCIÓN BACTERIANA Y TRANSFORMACIÓN BACTERIANA. RECUPERADO EL 1 DE MARZO DE 2015 DESDE:http://www.escuelapedia.com/transformacionbacteriana/ Documento Técnico Nº 6 Enfermedades emergentes y reemergentes MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Ministerio de Salud Ú Elaborado por: Dr. César Cabezas Sánchez CNSP Dr. Víctor Suárez Moreno CNSP Dr. Javier Vargas Herrera CNSP Dra. Silvia Herrera Bernuy CNPB Dra. Rosa Mostorino Elguera CNSP Blga. Sara Morales de Santa Gadea CNSP Dr. Alfredo Guillén Oneeglio UNFV.Catalogación hecha por el Centro de Información y Documentación del Instituto Nacional de Salud (INS) http://cidbimena.desastres.hn/docum/ops/libros/antrax.pdf CUERVO LOZADA. J.P.PONTIFICA UNIVERSIDAD JAVERIANA. FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS.AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE BACILLUS SP COMO FIJADORES BIOLOGICOS DE NITROGENO Y SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS EN DOS MUESTRAS DE BIOFERTILIZANTES COMERCIALES.201_BOGOTA. DESDE;
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis404.pdf E.GOTUZZO,C.MAGUIÑA,H.GUERRA, C.SEAS. ANTRAX EN EL PERU.2001_PERU.Desde; http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182001000400010 PELCZAR. M.J., REID R.D., CHAN E.C.S. ”MICROBIOLOGIA”. 1982. 2ª. EDITORIAL MCGRAW - HILL. MEXICO JOKLIK W.K., WILLETT. H.P., AMOS D.B., WILFERT.C.M. “MICROBIOLOGÍA”.1994. 20ª. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA S.A. ARGENTINA
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