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INFORME N°2 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS

BALLESTEROS MARTINEZ LUCIO MARTINEZ GONZALES MIGUEL HENAO RIVAS LUIS

Ph. D. DEIVIS LUJÁN RHENALS Ingeniero de alimentos

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BIOTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS BERASTEGUI, COLOMBIA 2016

INTRODUCCIÓN Los carbohidratos o azucares. Son compuestos formados por carbono, hidrogeno y oxígeno, sintetizados a partir de CO2 (Dióxido de carbono) y agua por los organismos fotosintéticos, mediante el aprovechamiento de la energía de la luz solar. En su estructura química presentan grupos hidroxilos (OH), aldehído (COH) o cetónico (C=O) (Vielma 2009). Los azúcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal que le confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. La determinación de estos azúcares se realizó con el objeto de obtener una gráfica de la absorbencia de las soluciones expuestas a DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico), reactivo que tiene la capacidad de oxidar a los azúcares reductores dando resultados colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 575nm. El método de DNS nos permite analizar una gran cantidad de muestras con

unos gastos minimos de reactivos. El DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico), permite calcular la concentración de azúcares reductores en distintos materiales o sustancias que son de común interés en la industria alimentaria. El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra que se esté analizando.

PROCEDIMIENTO, RESULTADOS Y ANALISIS

La determinación de azúcares reductores por el método DNS, se realizó con 6 muestras de solución de glucosa que diferían entre sí por su concentración (0, 200, 400, 600, 800 y 1000 ppm), Además de estas concentraciones se analizó una muestra problema cuya concentración era desconocida (cuadro 1). Cada una de las soluciones de sacarosa se mezcló con un mililitro de DNS con ayuda de un vortex, luego las muestras se sumergieron en agua caliente a una temperatura aproximada de 100ºC durante 5 minutos. Acto seguido las muestras se introdujeron en agua con hielo durante un corto tiempo. Después de ser retiradas del hielo se

añadieron 8 mililitros de agua destilada y

nuevamente se agito con ayuda del vortex luego se determinó absorbancia a una longitud de onda de 575 nm (Cuadro 2) De la muestra problema proporcionada por la auxiliar de laboratorio se tomó 1 mL de solución a esta se le adiciono 1 ml de DNS. Luego a dicha muestra se le aplico la misma metodología para la determinación de azucares reductores por DNS que a las otras muestras de sacarosa (cuadro 3).

Nº Tubo

mL de sln estándar

1 2 3 4 5 6

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ml agua destilada 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Concentración final (ppm) 0 200 400 600 800 1000 1:

Cuadro Nº concentración de soluciones de sacarosa

Nº Tubo

mL de sln estándar

1 2 3 4 5 6

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ml agua destilada 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Concentración Absorbancia final (ppm) 1 0,0 2 0,040 3 0,175 4 0,305 5 0,469 6 0,544

Cuadro Nº2: absorbancia de cada una de las concentraciones de sacarosa

Tubo

mL muestra problema

DNS ml

x

1

1

Absorbancia (575 nm)

Cuadro Nº3: Absorbencia de muestra problema

Con los datos de absorbancia arrojados por las diferentes soluciones

se

construyó la curva de calibración, en la cual se relacionan las concentraciones de las diferentes soluciones y dicha absorbencia medida en cada una de ellas. 0.6

f(x) = 0 x − 0.04 R² = 0.98

Absorbancia (575 nm)

0.5 0.4 0.3

Gráfico Nº1:

0.2

Absorbancia VS

0.1

concentración.

0 0

200

400

600

Concentracion (ppm)

800

1000

1200

El valor del R² obtenido en la gráfica

es un adato aceptado estadísticamente debido a que es mayor que 0,95 lo que

nos dice este valor de 0,9801 es que los datos no tienen mucha dispersión entre sí. Para calcular la concentración de la muestra problema se procedió a hacer uso de la ecuación de la recta y respectiva pendiente. y=mx+b Ecuación Nº1 Y (absorbancia) m (pendiente) b ( intercepto)

0.330 0,0006 -0,04

Cuadro Nº4:

parámetros de la ecuación de la recta

Al despejar la ecuación calculamos el valor de X que corresponde a la concentración problema: X=

(0 ,330+ 0 ,04 ) y−b =616.66 ppm X= m 0 , 0006

Con base a los cálculos obtenidos anteriormente podemos decir que la concentración de la muestra problema es aproximadamente 616.66 ppm. Se puede decir que existe cierto grado de confiabilidad ya que el coeficiente de determinación es de 0,9801 esto permite tener una seguridad media por parte del modelo lineal ya que se ajusta o representa de manera óptima a los datos experimentales. Las coloraciones que se presentaron en las muestras estudiadas (ANEXO) se deben a que el DNS reacciona con los azúcares reductores presentes en las soluciones en nuestro caso la sacarosa la cual es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa.

La sal de rochelle no se le adiciona a las muestras como se tenía previsto en la guía de trabajo debido a que no había de necesidad de fijar el color ya que el número de muestras era pequeño y no transcurría demasiado tiempo entre lectura de una muestra y la otra en el espectrofotómetro. Los tubos de ensayo utilizados en el procedimiento se sumergieron un una solución de ácido sulfúrico y posterior mente se secaron. Esto se realizó con la intención de eliminar cualquier rastro de un azúcar que pudiera estar presente en los tubos e interfiriera con los resultados del análisis de azúcares reductor. Para el análisis de la solución problema se tomó un mililitro de dicha solución y uno de DNS, debido a que con esta relación 1:1 se obtuvo una lectura de la absorbancia (616.66 ppm) que concordaba con una de las concentraciones de las muestras estudiadas cuya concentración si se conocía (600 ppm). Esto se realizó debido a que cuando se siguió el procedimiento propuesto en la guía se obtenían medidas inconsistentes.

CONCLUSIÓN Al culminar determinación de azúcares reductores por el método DNS se logró constatar que el ácido 3,5 dinitrosalicílico, presenta la capacidad de oxidar a los

azúcares

reductores

arrojando

como

resultados

distintos

tonos

colorimétricos que se pueden medir con una longitud de onda de 575nm por espectrofotometría en la que la absorbancia será directamente proporcional a la concentración de glucosa en las soluciones, dicha concentración de azucares reductores se obtendría al realizar una curva de calibración (concentración vs absorbancia). Como pudimos notar el método de DNS es un método sencillo de realizar y que a lo largo del tiempo ha tomado mucha importancia en trabajos investigativos por su eficacia al momento de evaluar o determinar dichos azucares reductores por otra parte es muy utilizado también alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico. Para lo que respecta a la solución problema es muy recomendable hacer distintas repeticiones en la que se varié su concentración pues no se tiene conocimiento de que tan diluida esta dicha solución, esto con el fin de realizar una lectura veraz en el espectrofotómetro.

CUESTIONARIO

1. Grafique la curva de calibración (Concentración vs Absorbancia) para la determinación de azúcares reductores con el método del DNS. Muestre todos los resultados obtenidos. Calcule el valor de R 2. 2. Calcule la concentración en azúcares reductores (Glucosa) de la muestra problema. Nota: las respuestas a la pregunta 1 y 2 fueron solucionadas en el desarrollo del informe 3. Consulte otros métodos utilizados para la determinación de azúcares reductores y glucosa. ¿Qué ventajas y desventajas presentan para su uso en biotecnología? MÉTODO DE FEHLING: Este ensayo pone de manifiesto la presencia de azucares reductores (aldosas: glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reacción redox en la que el grupo aldehído (reductor) de los azúcares es oxidado a grupo ácido por el Cu 2+ que se reduce a Cu+. Tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores reaccionan con el Cu 2+ dando un precipitado rojo de óxido cuproso. La reacción tiene lugar en medio básico por lo que es necesario introducir en la reacción tartrato sódico-potásico para evitar la precipitación del hidróxido cúprico. Ventajas: Estas variaciones han sido para cada tipo de alimento, en cualquier caso el principal logro de modificaciones ha sido mejorar la precisión de reducción y eliminar cualquier factor que interfiera con la producción de óxido de cobre, de los factores estudiados, la alcalinidad del reactivo, la proporción, el tiempo de calentamiento, la concentración del azúcar, son los más importantes. (Pomeranz, 1984). Desventajas: La prueba de Fehling no es específica; otras sustancias que dan reacción positiva son los fenoles, aminofenoles, benzoína, ácido úrico, catecol, ácido fórmico, hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol (Acasti).

La producción de óxido cuproso varia, dependiendo del reactivo álcali, la velocidad y tiempo de calentamiento y la concentración de azucares en la muestra.Los azucares difieren en su habilidad para reducir la solución cúprica (López 2014).

MÉTODO LANE-ENYON: Es un método volumétrico que consiste en la determinación del volumen necesario de la muestra problema que se necesita para reducir un reactivo alcalino de cobre. El punto final se establece en presencia de azul de metileno el cual se reduce a blanco de metileno si hay exceso de azúcares reductores. Ventajas: En condiciones especificadas, la cantidad de cobre reducido está en proporción con la cantidad de azúcares reductores presentes y también ha demostrado ser exacto y preciso en la determinación de azúcares reductores.

Desventajas: Los métodos de reducción del cobre para determinar la cantidad de azúcares reductores no son estequiometricas y tiene como

principal

inconveniente ser un método volumétrico donde el punto final de la valoración se detecta por cambio de color (Bello et all., 2006)

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES (GLUCOSA) POR HPLC: Es un método cromatográfico utilizado para separar componentes de una muestra que se dividen entre una fase móvil líquida y una fase sólida estacionaria conformada por partículas muy finas que se encuentran en una columna, y donde se utiliza una presión muy alta para permitir el paso del disolvente por medio de ésta, logrando así separaciones de alta resolución, para su posterior identificación y cuantificación. Ventajas Es el método de determinación de azúcares más preciso y confiable, tanto así que puede utilizarse para cuantificar azúcares mayoritarios y minoritarios, tiene gran solubilidad en agua

y aparte es idónea para la

separación de especies no volátiles o termolábiles.

Desventajas: Requiere mayores restricciones, por ejemplo la película resinosa que se use debe ser no porosa, debe tener elevada estabilidad a cambios de pH. (Contreras 2014).

MÉTODO DE MUNSON-WALKER: El método gravimétrico se conoce como la propuesta de Munson y Walker. El método gravimétrico corresponde a la cantidad de cobre reducido en presencia de azúcares reductores; el peso en miligramos de Cu2O corresponde a los miligramos de azúcares analizados, por medio de las tablas de Munson y Walker que aparecen en el AOAC. LA determinación del Cu2O puede ser gravimétrica, pero es generalmente mejor titular el óxido cuproso (Flores 2011). Ventajas: Es cuantificable, además de ser cualitativo también es relativamente sencillo y rápido

Desventajas: No se puede distinguir entre los diferentes azúcares reductores y Se requieren muestras relativamente grandes (100 a 200 mg) de glucosa por determinación.

Método Reductometrico De Luff-Schoorl Los azucares presentes en la muestra se hacen reaccionar con una solución carbonatada alcalina de concentración conocida de iones cobre (II) calentando a ebullición. El azúcar directamente reductor se oxida y los iones Cu2++ se reducirán a Cu+ que precipitaran como Cu2O. El exceso de Cu2++ se determina yodometricamente. Ventajas: Una ebullición de 10 minutos, la acción reductora de la glucosa y de la fructosa es por lo general igual en este espacio de tiempo permitiendo la elaboración de ambas. No requiere una titulación de la solución de la titulación en ebullición como en Lane-Eynon.

Desventajas: La reacción de los azúcares y la disolución de Luff no es estequiométrica, siendo necesario un control exacto de las condiciones de trabajo (temperatura de ebullición para lograr una fiabilidad y repetibilidad) ,en la reacción pueden interferir otras sustancias acompañadas que disminuirán la capacidad reductora de la disolución. Método de Brafoerd: Se utiliza para diferenciar entre mono y disacáridos reductores, contienen ion cúprico que se reduce a óxido cuproso más rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos. Ventajas: Permite diferenciar entre un monosacárido y un disacárido Desventajas: Sus resultados son poco confiables, el test de Benedict.

BIBLIOGRAFIA 

VICKIE A. VACLAVIK. Fundamentos de ciencia de los alimentos. Acribia. 2002. Zaragoza, España.

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FAJARDO C. SARMIENTO S. 2007. Evaluación de melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de grado para obtener el título de microbiólogo industrial. Universidad javeriana. Bogotá D.C:

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Badui, S. Química de los alimentos. Editorial alhambra. Ciudad de México, México. 2006.

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LUJÁN, Deivis. MENDOZA, Jairo. Guía n° 2: determinación de azucares reductores por el método DNS (Acido 3,5- Dinitrosalicílico). Manual de laboratorio de Biotecnología de alimentos. Universidad de Córdoba. Facultad de Ingeniería. Programa Ingeniería de Alimentos.

ANEXOS

Imagen Nº1: Agitacion en vortex de las muestras.

Imagen Nº2: Calentamiento de las muestas a 100ºC.

Imagen Nº4: coloración de diferentes [ ] de solución de sacarosa.

Imagen Nº5: coloración muestra problema y blanco.

Imagen Nº3: Enfriamiento de las muestras.

Imagen Nº6: lectura de absorbancia.