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BIOENSAYO DE TOXICIDAD EN ARTEMIA SALINA L. Medina R. Amisaddai J. Laboratorio de Farmacología L-202, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Av. Guelatao 66, Col. Ejército de Oriente, 09230, México D.F Resumen El bioensayo de toxicidad en la Artemia salina es una herramienta útil para el ensayo preliminar de sustancias con actividad biológica. El estudio se centró en la evaluación y verificación de la letalidad de las fracciones EtOH, Pb(C2H3O2), KSCN, HgCl2, K2Cr2O4 y. La valoración se llevó a cabo mediante el bioensayo en Artemia salina, a través del cual, se evidencia el siguiente proceso: determinar la concentración letal 50 (CL50) utilizando el medio artificial aproximadamente a una temperatura de 26-28OC y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubación después de 24 horas, preparar la solución patrón con una secuencia de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1,4,1.6, 1.8 y 2 mL por tubo y un volumen total de 2 mL y las mismas concentraciones para los demás reactivos. Comprobada la letalidad de las fracciones de los reactivos se mostró CL50 de 2.018 EtOH, 6.61 Pb(C2H3O2), 0.589 KSCN, 3.63 HgCl2, 0.386 K2Cr2O4 y 0.776 AgNO3 mg/ml respectivamente, siendo la más potente el reactivo con plomo. Introducción Bioensayo de toxicidad es una herramienta en la ectoxicologia una rama de la farmacología que combina las técnicas ecológicas y la química para determinar los efectos de que una sustancia puede tener en un organismo. Los bioensayos de toxicidad involucra la exposición de organismos a una serie de diferentes concentraciones de la sustancia y determinando la respuesta del organismo. La respuesta del organismo depende de la especie y el tipo de prueba puede incluir una reducción del crecimiento o supervivencia. Las especies o estados de vida que son especialmente sensitivos a las sustancias ideales para la prueba de toxicidad, por ejemplo los estados de desarrollo temprano de organismos marinos son más sensitivos que sus equivalentes adultos. Porque el estrés del medio ambiente afecta el desarrollo larvario y puede tener seria consecuencias potenciales para la población y el ecosistema y esos estados de vida tempranos son importantes para identificar el efecto dañino a su medio ambiente. Los bioensayos de toxicidad aguda son pruebas diseñadas para medir los efectos de sustancias en especies durante un corto tiempo. Los bioensayos, los cuales típicamente tardan de 48 a 96 horas, usualmente miden los efectos de sustancias en la supervivencia de la especie. Los resultados pueden ser reportados como CE50 la cual es la concentración efectiva de una muestra de prueba que causa un efecto especifico. Sin embargo, los ensayos de a) Incubación de los huevecillos toxicidad crónica son usados para sustancias de bajo nivel en situaciones del alto riesgo. Estas pruebas son de largo tiempo relativo a la vida de la especie utilizada y son diseñados para medir el desarrollo larvano o crecimiento y el éxito o falla de la reproducción. Marco Teórico Cuando un fármaco es administrado en un organismo sufre diferentes procesos (liberación, absorción, distribución, biotransformación o metabolismo y excreción). Durante este experimento se evaluó la eliminación renal de la sulfacetamida sódica en una rata a diferentes tiempos. La eliminación es el paso de fármacos desde el interior hacia el exterior del organismo, este fenómeno se rige por el proceso de difusión pasiva y activa. Una vez que un fármaco ha cumplido su acción terapéutica en el organismo y ha sufrido biotransformación, es eliminado del cuerpo por medio de la excreción renal principalmente, aunque existen otras vías como: gastrointestinal, biliar, salival, etc. Los bioensayos de toxicidad aguda son pruebas diseñadas para medir los efectos de sustancias en especies durante un corto

tiempo. Los bioensayos, los cuales típicamente tardan de 48 a 96 horas, usualmente miden los efectos de sustancias en la supervivencia de la especie. Los resultados pueden ser reportados como CE50 la cual es la concentración efectiva de una muestra de prueba que causa un efecto especifico. Sin embargo, los ensayos de toxicidad crónica son usados para sustancias de bajo nivel en situaciones del alto riesgo. Estas pruebas son de largo tiempo relativo a la vida de la especie utilizada y son diseñados para medir el desarrollo larvano o crecimiento y el éxito o falla de la reproducción. Objetivo Determinar la CE 50 y la potencia relativa de HgCl2 y de diferentes sustancias químicas por el método de bioensayo en artemia salina L, para determinar el grado de toxicidad de los mismos en el sistema de prueba. Hipótesis Mediante un bioensayo de toxicidad en una población de Artemia salina la cual es muy sensible a sustancias citotóxicas se podrá determinar el efecto dosisrespuesta de HgCl2 y los diferentes reactivos a concentraciones crecientes. Metodología Procedimiento:

Material biológico: • Huevecillos liofilizados de Artemia salina L. Cristalería y equipo: • Pecera de vidrio capacidad 2 L • Tubos de ensaye • Pipetas de vidrio • Jeringas de 1 mL • Foco sumergible de 5 W • Termómetro para pecera • Pecera de 500 mL • Matraz Erlenmeyer de 1 L

• Vasos de precipitados de 100, 500 mL • 5 Pipetas Pasteur con bulbo • Balanza • Gradillas • Aereador con manguera y filtro Reactivos: • Disolución de cloruro de mercurio (II) al 1 % • Disolución de sulfato de plata al 1%. • Agua de mar artificial • Anticloro (tiosulfato de sodio al 1 %)

1. Se arma el dispositivo de incubación

2. Se preparan 400 mL de agua de mar artificial, pesando 12.2 g de sal marina y disolver en un volumen final de 400 mL. Adicionar una gota de anticloro y dejar reposar durante 5 minutos.

4. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una temperatura de 26-28OC y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubación.

5. Conectar los dispositivos de aeración y luz.

6. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubación con una espátula limpia y seca (aproximadamente 10 μg de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500 mL. Dejar incubar durante 24 h.

mL de reactivo 0.2mL de aumento por cada tuvo de reactivo y 0.2mL de disminucion al vol. inicial de agua salina.

c) Realización del bioensayo

1. Se colocará el volumen de disolución de prueba en cada tubo de ensaye previamente marcado.

2. Se colocarán 10 nauplios de Artemia salina L. por cada uno de los tubos de ensaye, evitando agregar demasiada agua de mar artificial.

3. Se colocará el volumen de agua de mar artificial necesario para completar a un volumen total de 2 mL.

a) Los nauplios que presentan movimiento, aunque sea este mínimo, se consideran vivos.

b) Los nauplios que permanecen inmóviles, se consideran muertos

4. Se observará el movimiento de los organismos por un periodo de 120 minutos.

5. Al término del periodo de observación se contarán los nauplios de Artemia salina L. que sobrevivieron de la siguiente manera: .

3. De la solución anterior se colocan 300 ml en la pecera de incubación.

1. Las muestras se prepararán de acuerdo:

Resultados Cálculos para la realización de la gráfica

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto AgNO3 0/8 0/10 7/15m 9/10m 8/10j 8/9m 9/9k 9/9l 8/8l 7/8j 9/9k

Efecto HgCl2 0/8 0/8 3/8j 3/8j 3/8j 3/8j 3/8j 5/8h 6/8k 7/8j 8/8j

Efecto de P 0 0 0.46 0.9 0.8 0.89 1 1 1 0.875 1

Efecto de P

%E 6.2 5 46 90 80 89 94.4 94.4 93.75 87.5 94.44

%E

0 0 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.625 0.75 0.875 1

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto KSCN 0/10 0/9 2/10k 3/11j 2/10h 3/10l 5/11j 10/10l 9/9l 10/10l 10/10l

Efecto de P

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto EtOH 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l

Efecto de P

0 0 0.2 0.272 0.2 0.3 0.454 1 1 1 1

0 0 37.5 37.5 37.5 37.5 37.5 62.5 75 87.5 100

%E 0 0 20 27.2 20 30 45.4 100 100 100 100

%E

0 0 0 0 0.1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 0 10 100 100 100 100 100 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5.32 5 4.9 6.28 5.84 6.23 6.55 6.55 6.53 6.15 6.63

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

UP 5.32 5.32 4.68 4.68 4.68 4.68 4.68 5.32 5.67 6.15 6.53

SUSTANCIA EtOH Pb(C2H3O2) KSCN HgCl2 K2Cr2O4 AgNO3

Efecto K2Cr2O4 0/8 4/11j 1/9k 5/11k 10/12k 3/7u 13/13 9/9j 12/12j 10/10k 8/8h

DE50 2.018 6.61 0.589 3.63 0.386 0.776

Efecto P 0 0.36 0.11 0.45 0.83 0.428 1 1 1 1 1

%E 0 36 11 45 83 42.8 100 100 100 100 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5.32 4.64 3.77 4.87 5.95 4.82 6.76 6.63 6.73 6.64 6.53

Pr 0.556 1.821 0.162 1 0.106 0.214

UP 5 5.55 4.16 4.39 4.16 4.48 4.88 6.64 6.59 6.64 6.64 Análisis de resultados.

UP 5 5 5 5 3.72 6.64 6.64 6.64 6.64 6.64 6.64

En esta práctica se pudo observar que sustancia era la que mataba a la mayoría de las artemias y la toxicidad que producía viendo el número de muertes que provoca. Se observó que para la solución de K2Cr2O4 no mato a la mayoría de las artemias por que no es tan toxico a comparación del Pb(C2H3O2 ya que este al tener Plomo que al entrar en contacto con el organismo actúa mediante diversos mecanismos:a)- disminuye la producción de glóbulos rojos y su vida media al alterar su membrana y provocar su ruptura.y b)- disminuye la síntesis del grupo HEM en los eritroblastos de médula ósea, al inhibir tres enzimas de la ruta biosintética de este grupo. Dichas enzimas se denominan: aminolevulínico dehidratasa, Coproporfirinógeno oxidasa y Ferroquelatasa . Conclusiones

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto Pb(C2H3O2) 0/10 1/7l 3/9l 3/10l 1/8l 6/9l 9/11l 9/10l 5/9l 10/11l 0/11

Efecto de P 0 0.143 0.333 0.3 0.125 0.666 0.818 0.9 0.555 0.9 0

%E 0 14.3 33.3 30 12.5 66.6 81.8 90 55.5 90 0

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5 3.93 4.57 4.48 3.85 5.43 5.91 6.28 5.14 6.28 4.88

El bioensayo de toxicidad en artemia salina resulto muy importante para determinar y entender, la toxicidad que sufre un organismo en un medio. Esta práctica ayudo mucho a entender el efecto toxico que tienen algunos fármacos y no provocar algún daño que perjudique alguna persona. En este caso solo se analizó la potencia relativa de las fracciones EtOH, Pb(C2H3O2), KSCN, HgCl2, K2Cr2O4 para ver que tan toxico es en un medio de artemias. Siendo este el que contuvo plomo. Referencias • Farmacología humana, Katzung B. 3ra Edición, Editorial McGraw Hill. EUA. 1998. • Aiache, J.M.; Devissaguet, J. Ph. “Biofarmacia”. Edit. El Manual Moderno.México. 1983.