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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS “PRÁCTICA N.º 02” “NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES” DOCENTE: Prof. Linley Vega ALUMNA: Yulisa Yomira Arocutipa Alanoca CODIGO: 2018 -- 111041 CURSO: Práctica de Microbiología de los Alimentos II CICLO: 2020-1 GRUPO: B

TACNA – PERÚ 2020

INTRODUCCIÓN: El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos aerobios mesófilos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminación de la materia prima. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. La inmediata alteración del producto. El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos. FUNDAMENTO TEÓRICO: La aceptabilidad de un proceso es frecuente el aspecto más difícil del análisis de alimentos. Los análisis microbiológicos de los alimentos son una herramienta eficaz en esta evaluación, pero la interpretación de los resultados de laboratorio obtenidos en microbiología es, frecuentemente, el más difícil y complejo aspecto de todo el proceso de evaluación, donde entran en juego el criterio profesional y las circunstancias que rodean al hecho (brote, control de rutina, toma de muestras, etc.). Para una adecuada interpretación de los resultados es importante establecer que resultados son alcanzables y/o esperables. Son aquellos microorganismos que se desarrollan en presencia de oxígeno libre y a una temperatura óptima entre 20ºc y 45ºC en una zona óptima entre 30 y 40ºC. CARACTERISTICAS GENERALES:  

Conjunto de microorganismos capaces de multiplicarse en medios que presentan oxígeno y a temperaturas que oscilan entre los 25-40 ºC. Existen ciertos problemas durante el recuento en alimentos fermentados, ya que por naturaleza presentan una flora microbiana y en el recuento de productos esterilizados, ya

que la ausencia de agentes patógenos en el producto final no avala la inocuidad de la materia prima utilizada. RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS VIABLES El indicador de MTBAMV, es el más importante para calificar la correcta manipulación de la materia prima durante todo el proceso de producción y el buen uso de las Buenas prácticas de manipulación hasta obtener el producto alimenticio final.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA: • Conocer el método para determinar el número de microorganismos aerobios mesófilos viables. • Aplicar la correcta expresión de los resultados en UFC / ml de muestra.

EQUIPOS Y MATERIALES INSTRUMENTOS: • Placas Petri (7) • Tubos de ensayo (6) • Pipetas bacteriológicas de 10 y 1ml • Mortero • Balón (2) • Espátula • Gradilla • Mechero Bunsen

EQUIPOS: • Contador de colonias • Baño de agua regulado a 44- 46°C para mantener el agar licuado

• Baño de agua regulado a 29 – 31°C • Termómetro digital

MEDIOS DE CULTIVO: • Agar Plate Count • Agua Peptonada tamponada

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: AGUA DE PEPTONA TAMPONADA USOS: Se usa como diluyente o para el enriquecimiento no selectivo de microorganismos en muestras de comida y medioambientales. COMPOSICIÓN: Peptona de carne 10,0 g; Cloruro de sodio 5,0 g; Fosfato disodico 3,5 g; Fosfato monopotasico 1,5 g El pH final es de 7,0 ± 0,2 a 25°C.

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: PLATE COUNT AGAR (PCA) POLVO AERÓBICO Es un medio de cultivo sólido, no selectivo, diseñado para la cuantificación de la carga microbiana aerobia presente en muestras de aguas de consumo, aguas residuales, bebidas lácteas, entre otros alimentos. COMPOSICIÓN •Triptona 5,0 g •Extracto de Levadura 2,5 g •Glucosa 1,0 g •Agar-agar 10,5 g (Fórmula por litro)

pH final: 7,0 ± 0,2

PROCEDIMIENTO: 1. Recuento de microorganismos aerobios mesófilos a. Preparación y homogeneización de la muestra, suspensión inicial y diluciones decimales sucesivas. b. Inoculación de acuerdo al método utilizado de un medio de cultivo selectivo de una cantidad específica de la muestra problema, si es líquida o de la suspensión inicial si es sólida y de las diluciones sucesivas. c. Incubación en aerobios a 29°C - 31°C durante el tiempo establecido. d. Cálculo del RTBAMV por gramo o mililitro de muestra a partir del número de colonias obtenidas de las placas que dan resultados significativos

A. PREPARACIÓN Y HOMOGENEIZACIÓN DE LA MUESTRA: I. Preparamos la muestra. Pesando aproximadamente 10g de lechuga y con ayuda de un mortero trituramos la muestra.

II. Colocamos la muestra triturada en un Matraz con 90 ml de agua peptonada tamponada. Diluir.

DILUCIONES SUCESIVAS: III. Cambiando de pipeta retiramos del tubo 10-1 1 ml y lo agregamos a tubo 10-2 procurando solo tocar las paredes del tubo, así sucesivamente cambio de pipeta cada vez que se agregue a un nuevo tubo.

PLAQUEO EN MEDIO DE CULTIVO: • Pipetear por duplicado a placas Petri estériles alícuotas de 1 ml a partir de dilución 10-1 hasta 10-6. Agregar rápidamente 15 ml del agar licuado a una temperatura de 32°C hasta que cubra la muestra aprox. • Recuerde esterilizar la boca de la placa Petri, la boca del tubo y la embocadura del balón con el agar con la flama del mechero). Así sucesivamente hasta el tubo y la placa 10-6.

Mezclar inmediatamente la alícuota con el agar mediante movimientos de vaivén y rotación de las placas. Ejm.:

INCUBACIÓN: • Rotular, dejar solidificar el agar e invertir las placas. • Incubar durante 48 + 3 horas a 29 a 31 °C

CÁLCULO DE RESULTADOS: Computo del recuento estándar en placas – Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias utilizando un contador de colonias – Si las placas de diluciones consecutivas presentan menores que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos. – Si el número de colonias de las placas de 2 diluciones consecutivas están dentro del rango de 30300, computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación. Si el cociente es

menor a 2, reportar promedio de los 2 valores, pero si el recuento es mayor cociente a 2 veces o más que al menor, en este caso se reportará el recuento del menor. – Multiplicar por el factor de dilución reciproco de la dilución utilizada. Reportar el resultado como número de microorganismos aerobios mesófilos por gramo o mililitro según sea el caso.

Computo del estimado de recuentos estándar en placas - Si las placas de las diluciones muestran mas de 300 colonias, dividir cada duplicado de las placas de la dilución mas alta en secciones radiales convenientes (2,4,8) y contar todas las colonias en una o mas secciones. - Multiplicar el total en cada caso por el factor apropiado para obtener el numero de colonias por cada placa. Promediar los estimados de las 2 placas duplicadas y multiplicar por la dilución correspondiente. Reportar el resultado como estimado del número. - Si no hubiese colonias en placas de mayor concentración, reportar el estimado como menor que la inversa de la dilución. - Ejemplo: 10 -1 = 0 colonias - Se reporta como < 10 ufc/g o ml.

Expresión de resultados • Se deberá reportar únicamente 2 dígitos significativos, ellos son el primero y el segundo (comenzando por la izquierda) del promedio de los recuentos. Los demás dígitos se reemplazarán por cero. • Ejemplo: 523.000 se reportará 520.000 = 52x104u fe/ g o ml de alimento según el caso. • Si el tercer dígito de la izquierda es 5 o mayor que 5, adicionar una unidad al segundo dígito (redondear)

• Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptación o rechazo de un lote de alimentos, únicamente se considera el recuento estándar en placa, nunca el estimado del recuento, éste es útil solamente como una aproximación primaria en la determinación de la calidad microbiológica de un alimento. EJERCICIOS: REALIZAR EL CONTEO DE L AS SIGUIENTES PL ACAS Dilución 10 -1

Método adecuado para el conteo: 32 x 4 = 128 colonias Operación: Las placas Petri film RCC con un número de colonias Demasiado Numeroso Para contar (TNTC) tienen una o más de las siguientes características: cambio del color del gel de amarillo indio a ambar de hay va cambiando en otra pequeña parte que ocupa ¼ en la placa petri viene ser de ambar a ambar medio mostaza, muchas colonias pequeñas, muchas burbujas de gas. Resultado: No contable Dilución 10 -1

Método adecuado para el conteo: Básico solo contar las colonias Operación:

El Agar Triptona-Soja es un medio nutritivo general para una amplia variedad de usos. Debido a su excelente valor nutritivo, puede ser utilizado para el crecimiento y aislamiento de bacterias aeróbicas y para favorecer el desarrollo de la mayoría de microorganismos exigentes. Resultado: Contable  126 colonias Dilución 10 -2

Método adecuado para el conteo: Básico solo contar las colonias Operación: Un indicador amarillo en la placa colorea todas las colonias. Las bacterias acidificantes aparecen como colonias amarillas rodeadas por una zona gris y en el medio esta el amarillo indio. Pueden aparecer burbujas de aplicación debido a una siembra inadecuada en las placas Petrifilm para Enterobacteriaceae. No confundir con las burbujas de gas de las colonias. En el caso de burbujas de aplicación, tienen una forma irregular y no están asociadas a colonias rojas. Las partículas de alimento tienen a menudo formas irregulares o filamentosas y no están asociadas a burbujas de gas o zonas ácidas. Resultado: Contable  60 colonias Dilución 10 -3

Método adecuado para el conteo: Básico solo contar las colonias Operación:

Resulta fácil contar las colonias de enterobacterias en las placas Petrifilm para Enterobacteriaceae. Un indicador amarillo en la placa colorea todas las colonias y el film superior atrapa el gas en caso de que éste sea producido por las bacterias. Las bacterias acidificantes aparecen como colonias amarillas rodeadas por una zona gris y en el medio esta el amarillo indio asociado a la producción de ácido que es detectado por el indicador de pH del medio. Las colonias de enterobacterias tienen las siguientes características en las placas Petrifilm para Enterobacteriaceae: Las enterobacterias pueden producir colonias asociadas a burbujas de gas. Las enterobacterias pueden producir también colonias amarillas con zonas ácidas. Por último, las enterobacterias pueden producir colonias amarillas asociadas a zona ácida y burbujas de gas. Resultado: Contable  26 colonias Dilución 10 -4

Método adecuado para el conteo: Básico solo contar las colonias Operación: Recuento total con colonias hemisféricas (por siembra en superficie) y ovaladas (por siembra en masa). En su temperatura de 24-48 h a 37°C aproximadamente (o bien 72 h a temperatura ambiente, 21-28°C aproximadamente) .Hay como 11 colonias medianas de color blanco, tambien se encuentra como 10 colonias muy pequeñas, pero ahy una colonia que sobresale por su color amarillo y por un poco mas grande que todas las colonias.

Resultado: Contable  24 colonias COMPLETAR LOS RESULTADOS PARA LAS LECTURAS: Considerar los métodos de computo de recuento estándar en placa y estimado., así como la expresión de resultados. DISOLUCIÓN -1 -2 -3 -4 -5 -6

METODO DE CONTEO nx4 nx4 Basico Basico Basico Basico

PLACA S 318 260 45 17 5 0

PROMEDIO 326 216 50 14 3 2

322 238 95 31 8 2

TOTAL UFC/ML

EL CUESTIONARIO: ¿Cómo se utiliza este indicador para evaluar la calidad de las materias primas? Propiedades o parámetros generales que definen la calidad de un alimento (composición, estabilidad, pureza, estado, color, aroma). También se les llama atributos de calidad (quizá más bien cuando se expresan en forma de adjetivos: puro, estable, aromático).

Definición de Control de la calidad 1. Actividad reguladora de obligatorio cumplimiento realizada por las autoridades nacionales o locales para proteger al consumidor y garantizar que todos los alimentos, durante su producción, manipulación, almacenamiento, elaboración y distribución sean inocuos, sanos y aptos para el consumo humano, cumplan los requisitos de inocuidad y calidad y estén etiquetados de forma objetiva y precisa, de acuerdo con las disposiciones de la ley. 2. Sistema de inspección de análisis y de actuación que se aplica a un proceso de fabricación de alimentos de tal modo que a partir de una muestra pequeña pero representativa del alimento se esté en condiciones de juzgar la calidad del mismo. ¿Qué valores son aceptables para productos lácteos y cárnicos pasteurizados? Los alimentos y bebidas deben cumplir íntegramente con la totalidad de los criterios microbiológicos correspondientes a su grupo o subgrupo para ser considerados aptos para el consumo humano:

Con el fin de determinar la densidad microbiana en un yogur, grafique el procedimiento de preparación de diluciones de la muestra. ¿Porqué no se puede usar este indicador para productos fermentados?

Los organismos indicadores microbiológicos se pueden utilizar para controlar las condiciones higiénicas en la producción de alimentos. La presencia de bacterias, levaduras y mohos específicos es un indicador de higiene deficiente y de posible contaminación microbiológica. En la mayoría de las compañías se implementan sistemas HACCP para certificar la seguridad y uniformidad de los productos. Los potenciales riesgos físicos, biológicos y químicos pueden deberse a las materias primas, el proceso, el equipo, el entorno y los empleados. Gracias a nuestros sistemas de análisis rápidos y fiables, es posible comprobar fácilmente las materias primas, los productos finales, las líneas de producción, el personal y la eficiencia de la limpieza (agua de CIP) para determinar si existe contaminación microbiana. El término “recuento viable total sobre superficie” describe el número de unidades formadoras de colonias (CFU) que existen en un área definida (por ejemplo, 1 cm2) de la superficie analizada. Por lo general, se determinará mediante una placa de agar de recuento total empleando colonias cultivadas. Después de una incubación a 30 – 35 °C durante 48 horas aproximadamente, se realizará un recuento de colonias El recuento total viable es un indicador del estado higiénico de la producción de alimentos e indica posibles cargas microbianas y fuentes de contaminación. El “recuento aerobios mesófilos” indica el número de unidades formadoras de colonias (CFU) en un medio de recuento de placa durante el periodo de incubación especificado a temperaturas mesófilas (aproximadamente 30 – 37 °C). El recuento de aerobios es un indicador del estado microbiano de la producción y las condiciones ambientales. ¿Cuál es la composición del medio de cultivo Plate Count?      

Triptona                        5,00 g Extracto de levadura     2,50 g Glucosa                         1,00 g Agar-agar                      15,00 g (Fórmula por litro) pH final:     7.0 ± 0,2

En base a la pregunta anterior, calcule la cantidad (gr.) de Medio de cultivo sólido de P.C. necesario para el inóculo de 24 placas con agar P.C.

CONCLUSIONES: Segun los datos de los microorganismos no son muy buenos indicadores, pero uso justificado por: higiene alimentaria. •La presencia de un número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien a temperatura corporal o próxima a ella, significa que pueden haberse dado condiciones favorables a la multiplicación de los microorganismos patógenos de origen humano o animal. •Todas las BACTERIAS PATOGENAS conocidas vehiculadas por los alimentos son mesófilas y en algunos casos contribuyan con su presencia a los recuentos en placa encontrados • En los alimentos tratados por el calor, la población de microorganismos viables suele ser muy baja, aunque un examen microscópico de estos productos puede a veces poner de manifiesto la presencia de microorganismos muertos, cuyo número indica que la materia prima estaba muy contaminada. • Los recuentos de bacterias mesófilas no explican la vida útil en un alimento conservado en refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos no crecen a temperaturas por debajo de los 5ºC. Para esta finalidad es preferible el recuento de bacterias viables psicrotróficas con temperaturas de incubación entre 0 y 5 ºC durante 10 días.

RECOMENDACIONES:  Limpiar bien el área de trabajo y usar guantes para manipular las muestras  Desinfectar los instrumentos para realizar el trabajo  Al momento de preparar la muestra combinar bien para evitar que las colonias se peguen a los bordes de la placa Petri.  Selecciona para hacer el recuento aquella dilución donde haya crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias, en ahy se utiliza el método cuenta colonias .  Cuente las colonias y el número encontrado deberá multiplicarlo por el reciproco de la dilución que utilizo para hacerlo . BIBLIOGRAFIA:  Granados R. Microbiología Tomo II.2ª edición. 2003. Editorial Thomson Paraninfo  Koneman Diagnóstico Microbiológico 6ª edición. 2008. Editorial Médica Panamericana  Murray P. Microbiología Médica. 5ª edición 2008. Editorial Elsevier