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• Oscar Zavala Vargas

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• Análisis

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

1



Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos.

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05/11/2012

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Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis propuestos en las condiciones descritas.  La validación es la herramienta que permite obtener las pruebas documentales al respecto.  Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad, minimiza el número de fallas y repeticiones. 

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3

Conocimiento del método analítico.  Cumplir con las exigencias legales (registros, BPL), con el fin de asegurar la calidad y eficacia del producto.  La validación es un requisito previo de los procesos de transferencia de métodos analíticos. 

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Ensayos de identificación.  Ensayos para determinar el analito en materia prima o en FF.  Ensayos para determinar características farmacotécnicas (disolución).  Ensayos de límite de impurezas y cuantificación de las mismas.  Ensayos microbiológicos. 

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

BPL. › Personal. › Instalaciones. › Equipos, Instrumentos, Materiales. › Productos de Referencia. › Documentación, etc. › Auto inspección.

Reactivos

procedimientos

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y

escritos,

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Los métodos de farmacopeas se consideran oficiales.  Métodos de Análisis para Materias Primas. 

› Se consideran válidos. No es necesario realizar ninguna revalidación a la hora de poner el método en marcha en cualquier laboratorio. › Estos métodos han sido sometidos a ensayos inter-laboratorio para confirmar su buen funcionamiento. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Métodos de Análisis para FF. › FF de composiciones diferentes a nivel cualitativo (excipientes) y/o cuantitativo. › El método se considera parcialmente validado (con el consiguiente ahorro de costes en el desarrollo del método). › Se evalúa que parámetros son necesarios validar (de acuerdo al método), siendo la exactitud y la selectividad los parámetros más frecuentemente afectados. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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





Métodos desarrollados por el laboratorio, usados por algún tiempo, deben sufrir un proceso de validación. Para validar de manera satisfactoria y sin el uso de recursos innecesarios, es necesario contar con métodos lo suficientemente robustos. Para lo cual todo método analítico no oficial debe seguir una secuencia lógica de fases en su desarrollo, que oriente a una validación exitosa. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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



La secuencia óptima de experimentos para el desarrollo de un método, depende del método en si mismo. El desarrollo lógico de un método analítico transcurre con las siguientes fases secuénciales: 1. Definición de las características de practicabilidad. 2. Estudios de robustez y estabilidad de la muestra preparada para análisis. 3. Puesta a punto (aptitud del sistema). 4. Características de fiabilidad. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Se debe evaluar: › Precisión exigible. › Sensibilidad deseable. › Grado de selectividad. › Tiempo y costo. › Tamaño de la muestra. › Calificación del personal. › Tipos de equipos y/o instrumentos. › Condiciones de seguridad, etc. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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La estabilidad de la muestra preparada para análisis se evalúa durante la fase de desarrollo del método junto con la robustez.  La estabilidad se evalúa de acuerdo al tiempo requerido para su análisis.  Si la estabilidad de la muestra afecta al resultado en el periodo de tiempo evaluado, se hace constar en el método de análisis. 

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Ensayos que garantizan el buen funcionamiento del sistema en el momento de análisis.  El estudio de robustez se utiliza para optimizar y evaluar la criticidad de los parámetros del método antes de validarlo.  A partir de este estudio se define la aptitud del sistema.  La comprobación de la aptitud del sistema forma parte integral del método y debe realizarse cada día al inicio del análisis para comprobar el correcto funcionamiento del sistema. 

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La validación en sí es una fase más del desarrollo del método analítico.  Está última etapa permite conocer las características de fiabilidad del método para su aplicación rutinaria.  Demuestran la capacidad de un método analítico para mantener los criterios de validación a lo largo del tiempo. 

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Parámetros

Identificación

Impurezas Cuantitativo

Prueba límite

Valoración disolución

Exactitud

No

Si

No

Si

Precisión

No

Si

No

Si

Repetibilidad

No

Si*

No

Si

Precisión intermedia

No

Si

No

Si*

Si

Si

Si

Si

Linealidad y rango

No

Si

No

Si

LD

No

No

Si

No

LC

No

Si

No

No

Robustez

No

Si

No

No*

Selectividad

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Verificación documentada de que un método analítico (previamente validado) continúa siendo fiable en el tiempo o tras realizar modificaciones al método original.  Causas de revalidación. 

› › › ›

Paso del tiempo. Cambio en la muestra. Cambio de instrumento y materiales. Cambio de laboratorio. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

La robustez, de un método analítico, es la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en ciertos parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o “estabilidad” durante su empleo de rutina.

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

No debe confundirse con el término Ruggedness, que es el grado de reproducibilidad de los resultados en el análisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones tales como: › Diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, lotes de reactivos, días, tiempos, diferentes temperaturas, etc.

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Permite conocer la estabilidad del método ante pequeñas modificaciones y su independencia frente a éstas.  Permite conocer las condiciones de trabajo óptimas en cada paso del procedimiento de análisis.  La robustez no se considera como un parámetro de validación, sino como el estudio que permite conocer: 

› Las condiciones óptimas de trabajo para las diferentes variables estudiadas. › Las variables críticas que han de ser controladas. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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Todos los métodos sea cual sea la técnica empleada, son susceptibles de ser sometidos a un estudio de robustez.  Algunos pueden tener muchos parámetros sobre los que actuar y otros menos.  La primera etapa es analizar todo el método y definir que factores son los que influyen en el resultado final. 

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

Normalmente se usan dos tipos de diseños factoriales: › Diseños factoriales completos y fraccionados. › Diseños de Plackett – Burman y Youden – Steiner.



Por razones de interpretación estadística, es conveniente que el número de factores a evaluar sea como mínimo de tres y de ocho el número mínimo de experimentos. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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 





El diseño Youden – Steiner es el método clásico para estudiar la robustez. Permite estudiar el efecto de la modificación de 7 factores descritos en el método mediante 8 experimentos. Los valores nominales para cada factor en el método corresponden a las letras mayúsculas (A, B, C, etc.). Los valores alternativos están indicados por letras minúsculas (a, b, c, etc.). M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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1. 2.

3. 4.

Determinar los factores (deben ser 7) a ser estudiadas. Si el número de variables es inferior a 7, a los factores que quedan sin variable se las debe asignar una operación sin influencia analítica (“dummy”). Registrar las variables y sus valores (nominal y alternativo). Realizar los 8 experimentos según la matriz de factores especificada. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Para la determinación de la robustez de un método analítico por HPLC, se estudiaron las siguientes variables del método. Factor

Valor Nominal

Factor

Valor Alternativo

Flujo

A

1 ml/min

a

1.5 ml/min

Temperatura

B

40 ºC

b

25 ºC

Precolumna

C

A

c

B

Tipo de columna

D

X

d

Y

pH

E

7.6

e

7.4

[c] de la fase móvil

F

70/30

f

65/35

Tiempo antes de la inyección

G

1 hora

g

12 horas

Variable

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05/11/2012

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Exp

Factores

Resultados

A/a

B/b

C/c

D/d

E/e

F/f

G/g

1

A

B

C

D

E

F

G

s=

2

A

B

c

D

e

f

g

t=

3

A

b

C

d

E

f

g

u=

4

A

b

c

d

e

F

G

v=

5

a

B

C

d

e

F

g

w=

6

a

B

c

d

E

f

G

x=

7

a

b

C

D

e

f

G

y=

8

a

b

c

D

E

F

g

z=

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05/11/2012

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Exp

Factores

Eficiencia (N)

A/a

B/b

C/c

D/d

E/e

F/f

G/g

1

A

B

C

D

E

F

G

s=

6540

2

A

B

c

D

e

f

g

t=

6250

3

A

b

C

d

E

f

g

u=

4789

4

A

b

c

d

e

F

G

v=

4890

5

a

B

C

d

e

F

g

w=

4985

6

a

B

c

d

E

f

G

x=

5010

7

a

b

C

D

e

f

G

y=

6589

8

a

b

c

D

E

F

g

z=

6160

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

Para cada factor se calcula la diferencia de medias (V) en forma individual según: F a c t o r o V a r ia b le A – a B – b C – c D – d E – e F – f G - g

D if e r e n c ia

 t  u  v  w  x  y  z   A 4 4 s  t  w  x   u  v  y  z  VB  4 4 s  u  w  y   t  v  x  z  VC  4 4 s  t  y  z   u  v  w  x  VD  4 4 s  u  x  z   t  v  w  y  VE  4 4 s  v  w  z   t  u  x  y  VF  4 4 s  v  x  y   t  u  w  z  VG  4 4 V



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s

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

Resultados: VA = VB = VC = VD = VE = VF = VG =

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05/11/2012

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

Resultados: VA =

68.75

VB =

89.25

VC =

148.25

VD =

1466.25

VE =

53.75

VF =

15.75

VG =

211.25

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

Para decidir si un parámetro tiene influencia significativa sobre el resultado, es necesario conocer la variabilidad (repetibilidad) normal de la respuesta (N).

SI : V A  s 2  

Existe diferencia significativa M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

estadísticamente 05/11/2012

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

Supongamos que la repetibilidad es de 95.8, determinar si alguna variable influye significativamente.

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05/11/2012

32



Se realizo un estudio de robustez de un método analítico tomando en cuenta las siguientes variables. Variable

Nivel

Código

Nombre

(-)

(+)

A

Analista

X

Y

B

Filtración

Con filtración

Sin filtración

C

Tiempo de análisis

Después de 10 minutos

Después de 60 minutos

D

Blanco

Blanco correspondiente

Agua destilada

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Se usa un diseño estadístico experimental factorial fraccionado 24-1 = 8, solo nos interesa los efectos principales, la matriz del diseño experimental es:



Valores Codificados A B C D

A

B

1

-

-

-

-

X

Con filtración

10 minutos

Correspondiente

8

2

+

-

-

+

Y

Con filtración

10 minutos

Agua (d)

6

3

-

+

-

+

X

Sin filtración

10 minutos

Agua (d)

1

4

+

+

-

-

Y

Sin filtración

10 minutos

Correspondiente

7

5

-

-

+

+

X

Con filtración

1 hora

Agua (d)

3

6

+

-

+

-

Y

Con filtración

1 hora

Correspondiente

4

7

-

+

+

-

X

Sin filtración

1 hora

Correspondiente

5

8

+

+

+

+

Y

Sin filtración

1 hora

Agua (d)

2

Exp

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Valores Reales C

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Orden

D

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

Resultados: Exp

A

B

C

D

AxB

AxC

AxD

Abs

1

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

0,796

2 3 4 5 6 7 8

0,800 0,801 0,798 0,794 0,796 0,800 0,802

Σ(+) + Σ(-) Σ(+) – Σ(-) Efectos = texp = Valor P =

s= M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

(0.00175) 2  (0.00075) 2  (0.00225) 2 s 3

Resultados: Exp

A

B

C

D

AxB

AxC

AxD

Abs

1

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

0,796

8

+ + + +

Σ(+) + Σ(-)

6,387

6,387

6,387

6,387

6,387

6,387

6,387

Σ(+) – Σ(-)

0,005

0,015

-0,003

0,007

-0,007

0,003

0,009

Efectos =

0,0013

0,0038

-0,0008

0,0018

-0,00175

0,00075

0,00225

texp =

0,7346

2,2037

-0,4407

1,0284

Valor P =

0,5033

0,0923

0,6822

0,3619

2 3 4 5 6 7

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0,800 0,801 0,798 0,794 0,796 0,800 0,802

s=

0,001702 36



Entonces:

t( 0.05,3)  3.182

Gráf ico de Pareto para los Ef ectos Principales, Estandarizados (response is ABSORBANCIA, Alpha = ,05)

FILT RACIÓN

BLANCO

ANALIST A

MPO DE ANÁLISIS

0

1

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2

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

  



Con un 95% de confianza se asegurar que ninguna de las variables en estudio afectan de manera significativa a los resultados. El método de análisis propuesto posee buenas características para poder ser validado. Se puede predecir que el método no depende del analista y que la solución preparada es muy estable. La filtración de la solución resulto no significativa, no hay retención del analito en el filtro, ni contaminación por parte del filtro, sin embargo tiene el mayor efecto, mantener la filtración. Usar como blanco agua destilada no afecta significativamente los resultados. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Se prepara suficiente cantidad de una muestra homogénea y se almacena en diferentes condiciones ambientales: Tiempo

Condiciones normales

Temperatura de 40 ºC

Luz solar directa

Oscuridad

0 horas

0.N

-----

-----

-----

1 hora

1.N

1.T

1.L

1.O

2 horas

2.N

2.T

2.L

2.O

4 horas

4.N

4.T

4.L

4.O

20 horas

20.N

20.T

20.L

20.O

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

Resultados después de 1 hora. Replica

Tiempo cero

Condiciones Normales

Temperatura (40 ºC)

Luz solar

Oscuridad

1

0.772

0.772

0.779

0.762

0.771

2

0.777

0.775

0.778

0.766

0.778

3

0.775

0.769

0.781

0.766

0.777

4

0.779

0.778

0.777

0.761

0.778

5

0.777

0.777

0.78

0.764

0.78

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

Resultados después de 2 horas. Replica

Condiciones Normales

Temperatura (40 ºC)

Luz solar

Oscuridad

1

0.774

0.779

0.751

0.777

2

0.776

0.78

0.748

0.775

3

0.777

0.779

0.749

0.781

4

0.777

0.777

0.749

0.778

5

0.778

0.78

0.752

0.775

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

42



Resultados después de 4 horas. Replica

Condiciones Normales

Temperatura (40 ºC)

Luz solar

Oscuridad

1

0.777

0.781

0.747

0.777

2

0.778

0.774

0.743

0.778

3

0.778

0.783

0.741

0.775

4

0.78

0.771

0.74

0.773

5

0.772

0.78

0.747

0.777

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05/11/2012

43



Resultados después de 20 horas. Replica

Condiciones Normales

Temperatura (40 ºC)

Luz solar

Oscuridad

1

0.777

0.776

0.738

0.779

2

0.778

0.77

0.739

0.779

3

0.78

0.775

0.741

0.778

4

0.777

0.774

0.735

0.777

5

0.775

0.776

0.738

0.773

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05/11/2012

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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

Selectividad. › Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultáneamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que pueden estar en la muestra (precursores de síntesis o subproductos de la misma, impurezas, excipientes, productos de degradación, etc.)

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05/11/2012

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La selectividad se debe determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parámetro de validación.  Debe conocerse en que grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito sin interferencias de otras sustancias relacionadas (falsos positivos). 



Especificidad y selectividad. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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

Ensayos de identificación.

› Demostrar que el método es capaz de discriminar entre el analito y sustancias de composición similar u otros productos que pueden estar presentes en la muestra.



Ensayos de pureza.

› Garantizar que el método permite una evaluación de las impurezas y los productos de degradación.



Determinación cuantitativa.

› El método debe evitar la interferencia de excipientes, productos de degradación y/o impurezas en la respuesta proporcionada. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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

Adición de interferencias. › Prueba la selectividad de un método en análisis de rutina como también para métodos utilizados en pruebas de estabilidad.



Aplicación de técnicas confirmatorias con muestras sometidas a estrés. › Si no se cuenta con las interferencias se puede degradar la molécula por exposición a condiciones extremas de estrés. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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

Muestras sometidas a estrés. › Se prepara las muestras a la concentración de trabajo teórica.  Analito  Analito + Matriz  Matriz › Se determina las posibles rutas de degradación y metabolitos (estructura química y bibliografía). › Someter las muestras preparadas a condiciones de estrés. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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MUESTRA

TERMÓLISIS

HIDRÓLISIS

ACUOSA

ÁCIDA

FOTÓLISIS

OXIDACIÓN

BÁSICA

JOSE QUISPE VARGAS HCl 0.1 NM.Sc. JUANNaOH 0.1 N 05/11/2012

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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Muestra del fármaco XX

estándar

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

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Muestra del fármaco XX bajo condiciones forzadas

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

55

No se observan picos en los tiempos de retención del componente principal y las impurezas.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

56

Las impurezas conocidas deben estar separadas entre sí y del pico principal (Resolución  1,5)

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS 57 de 69

05/11/2012

Cromatograma de la muestra no sometida a condiciones forzadas de degradación

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS 58 de 69

05/11/2012

Cromatograma de la muestra sometida a condiciones forzadas: los productos de degradación están separados del pico principal, R  1,5

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS 59 de 69

05/11/2012



La determinación de selectividad de un método analítico muestra los siguientes resultados:

Replica 1

A Analito sin excipientes (Absorbancia) 0.782

B Analito con excipientes (Absorbancia) 0.771

Replica 2

0.775

0.778

Replica 3

0.770

0..777

Replica 4

0.789

0.787

Replica 5

0.778

0.782

Replica 6

0.788

0.789

Nº de replicas

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

60

Para determinar si existe diferencia significativa entre las medias de dos grupos de datos, se recurre a la prueba “t de student”.  Antes se debe verificar: 

› La normalidad de la distribución muestral para cada grupo. › Homogeneidad de varianzas (prueba F).

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

61



Homogeneidad de varianzas. › Planteamiento de hipótesis:  H0 → s²A = s²B  H1 → s²A ≠ s²B

Fexp

2 1 2 2

s  s

s s 2 1

2 2

Fexp  Ftab  se acepta H 0

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62



Resultados.

Fexp  1 .2308

F( 0.05 , 5 , 5 )  5 .0503

Se acepta la H0, la prueba F demuestra homogeneidad de varianzas.  Prueba “t de student”. 

 H 0 → µA = µB  H 1 → µA ≠ µB M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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63



Para varianzas homogéneas. s

nn  1s 2A  nb  1sB2 nA  nB  2

x

t  s

A

 x

s 

s

2 A

 s 2

2 B

B

1 1  nA nB M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

gl  nA  nB  2

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64



Resultados.

t exp  0 . 0814 

t ( 0 . 05

, 10 )

 2 . 2281

Se acepta la H0, el método analítico es selectivo

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65



Para varianzas heterogéneas.

t

x A  xB 2 A

2 B

s s  n A nB M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

2

s s     nA nB   gl  2 2 2 2  sA   sB       n A    nB  n A  1 nB  1 2 A

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2 B

66

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67



Rango.

› Intervalo entre la concentración superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método descrito.



Linealidad.

› Es la capacidad del método de producir resultados directa o indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad de analito en una muestra, dentro de un intervalo determinado. › En algunos casos se requiere de una transformación matemática de la respuesta. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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68



Dos tipos de estudios de linealidad:

› Linealidad del Sistema, donde se realizan los ensayos con la presencia única del analito. › Linealidad del Método, en la cual los ensayos se realizan en presencia del analito y la matriz correspondiente.





El rango debe definirse antes de realizar cualquier prueba, por lo general se deriva de las especificaciones del producto. Debe incluir el rango de especificaciones completo y extenderse ligeramente en ambas direcciones. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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69



El rango no debe extenderse más halla de las concentraciones que se consideran dentro de las posibilidades.

› “r” equivocadamente aceptables › Concentraciones extremas podrían rebasar los límites de linealidad





Siempre que sea posible se busca una respuesta lineal que facilite su trazado, interpolación e interpretación. Pero si las respuestas son no lineales, pero proporcionales a la concentración, se usan otros ajustes matemáticos. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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70



Comparar la linealidad del sistema con la linealidad del método, si no corresponden, esto evidencia un efecto de la matriz. MULTIPLICATIVO ADITIVO

ANALITO

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71



Aplicación. › Valoración del contenido de p.a. › Prueba de disolución. › Cuantificación de impurezas.



Determinación. 1. Determinar el rango de estudio. 2. Dentro del rango se define por lo menos 5 niveles de concentración (k = 5). 3. Realizar por lo menso 3 replicas para cada k. 4. Mínimo total de determinaciones, n = 15. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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72







Lo correcto es analizar las muestras de forma aleatoria, pero, se establece como criterio práctico analizarlas en sentido creciente de concentración. Lo ideal es hacer pesadas independientes (15 pesadas), ya que a sí se elimina el posible error sistemático que se podría arrastrar partiendo de una sola pesada. No obstante, se acepta una pesada madre y posteriores diluciones si se asegura una precisión y exactitud en la pesada madre y en las posteriores diluciones. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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73

En las pruebas de linealidad de un p.a. que se determina a 100 µg/ml, se adopto como rango el intervalo entre 80% - 120%.  Se trabajo a 5 niveles de concentración (80, 90, 100, 110 y 120 µg/ml) por triplicado. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla.  Determinar si el método de análisis cumple con los requisitos de linealidad. 

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[c] µg/ml

Replica 1

Replica 2

Replica 3

80

6439.77

6433.33

6440.72

90

7244.74

7237.49

7245.81

100

8066.01

8093.94

8071.58

110

8858.93

8896.66

8821.48

120

9699.63

9651.66

9638.78

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75



Pruebas a realizar. › Regresión lineal. › Prueba de hipótesis para “r” y “r2”. › Prueba de hipótesis para la pendiente (b). › Prueba de hipótesis para la ordenada al origen “a”. › Homogeneidad de varianzas. › ANOVA.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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76

x (μg/mL)

y (área)

80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120

6439.77 6433.33 6440.72 7244.74 7237.49 7245.81 8066.01 8093.94 8071.58 8858.93 8896.66 8821.48 9699.63 9651.66 9638.78

∑x

∑y

x²

y²

xy

∑x²

∑y²

∑xy

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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77

x (μg/mL)

y (área)

x²

y²

xy

80 80 80 90 90 90 100 100 100 110 110 110 120 120 120

6439.77 6433.33 6440.72 7244.74 7237.49 7245.81 8066.01 8093.94 8071.58 8858.93 8896.66 8821.48 9699.63 9651.66 9638.78

6400 6400 6400 8100 8100 8100 10000 10000 10000 12100 12100 12100 14400 14400 14400

41470637.65 41387734.89 41482874.12 52486257.67 52381261.5 52501762.56 65060517.32 65511864.72 65150403.7 78480640.74 79150559.16 77818509.39 94082822.14 93154540.76 92906079.89

515181.6 514666.4 515257.6 652026.6 651374.1 652122.9 806601 809394 807158 974482.3 978632.6 970362.8 1163955.6 1158199.2 1156653.6

∑x

∑y

∑x²

∑y²

∑xy

1500

120840.53

153000

993026466.2

12326068.3

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78



Regresión lineal. b 



xy 



x2 

r

 x

y

n  x 2

y  b x  a n

n x y   xy  n

2 2         x y  x 2    y 2      n  n    

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79



Regresión lineal. › a = -11.14133333. › b = 80.67176667. › r = 0.999818604. › r2 = 0.9996.



Prueba de hipótesis para “r”  H0 → No hay correlación entre x e y.  H1 → Existe correlación entre x e y.

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80



Prueba de hipótesis para “r”.

texp 

r  n 2 1 r

2

› Resultados:  texp = 189.27  t(0.05, n-2) = 2.16 › Existe correlación significativa entre x e y.

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05/11/2012

81



Prueba de hipótesis para “b”.  H0 → b = 0  H1 → b ≠ 0

t exp 

b

sb 

x

sb s2 xy 

s 2 xy

 x  

2

2

n

2 y   ay bxy

n2

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82



Prueba de hipótesis para “b”. › sb = 0.4262239 › s2xy =545.0004469 › texp = 189.27 › t(0.05,n-2) = 2.16 › Se rechaza H0, entonces “b” significativamente diferente de cero.



es

Límites de confianza para “b”.

b '  b  t  Sb M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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83



Límites de confianza para “b”. › No deben incluir al cero. › t(0.05,n-2) = 2.16. › 79.75 < b < 81.59.



Prueba de hipótesis para “a”.  H0 → a = 0  H1 → a ≠ 0

t exp

a   Sa

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Sa  Sb  2

05/11/2012

2 x 

n 84



Prueba de hipótesis para “a”. › Sa = 43.046504 › texp = 0.2588 › t(0.05,n-2) = 2.16 › Se acepta la H0, “a” no es significativamente diferente de cero.



Límites de confianza para “a”.

a ' a  t  Sa M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

85



Límites de confianza para “a”. › Deben incluir al cero. › t(0.05,n-2) = 2.16. › -104.14 < a < 81.86



Homogeneidad de varianzas. s12  s22  ...  sK2

G ex p

s m2 á x i m o s m2 á x i m o   2 2 2 2  s i s 1  s 2  ...  s i

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86

y

y-a

f ((y-a)/x)

Promedio f

s

s²

6439.77 6433.33 6440.72 7244.74 7237.49 7245.81 8066.01 8093.94 8071.58 8858.93 8896.66 8821.48 9699.63 9651.66 9638.78

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

87

y

y-a

f ((y-a)/x)

6439.77 6433.33 6440.72 7244.74 7237.49 7245.81 8066.01 8093.94 8071.58 8858.93 8896.66 8821.48 9699.63 9651.66 9638.78

6450.91 6444.47 6451.86 7255.88 7248.63 7256.95 8077.15 8105.08 8082.72 8870.07 8907.80 8832.62 9710.77 9662.80 9649.92

80.636 80.556 80.648 80.621 80.540 80.633 80.772 81.051 80.827 80.637 80.980 80.297 80.923 80.523 80.416

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Promedio f

s

s²

80.614

0.0503

0.0025

80.598

0.0503

0.0025

80.883

0.1478

0.0219

80.638

0.3417

0.1168

80.621

0.2672

0.0714

05/11/2012

88



Homogeneidad de varianzas. › Gexp = 0.5429 › G(0.05,k,n-1) = 0.6838 › Si Gexp < G(0.05,k,n-1), entonces se acepta la H0.



ANOVA. Fv Regresión Error Desvio Dentro Total

gl 1 n-2 k-2 n-k n-1

SC

CM

Fexp

Ft

SCr SCE SCl SCep SCt

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89



ANOVA (SCr). SC r 

x   Sxx  x 

2

2

n

S xy 2 S xx

xy  Sxy  xy  n

› Sxx = 3000 › Sxy = 242015.3 › SCr = 19523801.81 M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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90



ANOVA (SCep y SCl).

 y   SCep  y  m

2

j

2

y  y    SCec   2

2

j

mj

j

n

SCl  SCec  SCr › SCep = 5392.941 › SCl = 1692.06481

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

91



ANOVA (SCE).

 y   y     SCec  2

2

j

mj

SC E  SC l  SC ep

n

› SCec = 19525493.88 › SCE = 7085.00581

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

92



ANOVA.

Fv

gl

SC

CM

Fexp

Ft

Regresión Error Desvio Dentro Total

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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93



ANOVA.

Fv Regresión Error Desvio Dentro Total

gl

SC 1 19523801.81 13 7085.00581 3 1692.06481 10 5392.941 14 19530886.82

CM 19523801.81 545.0004469 564.0216034 539.2941

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

Fexp

Ft

35823.5

4.667

1.046

3.708

94



ANOVA (SCE). › Si F1exp > F1tab, esto demuestra la existencia de una pendiente diferente de cero, entonces, la regresión es estadísticamente significativa. › Si F2exp > F2tab, esto demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

95

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

96

La exactitud de un método analítico es el grado de concordancia o la diferencia entre la media de los resultados del ensayo obtenidos por el método y el verdadero valor aceptado como correcto.  Se conoce también como error sistemático o sesgo. 

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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97



No deben confundirse exactitud y precisión. › La precisión esta relacionada con la dispersión de una serie de mediciones pero no da ningún indicativo de lo cerca que está del valor verdadero. › Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión.



No siempre se obtienen valores de recuperación cercanos al 100 %, ya que esta depende de la matriz de la muestra, de la efectividad del método de preparación y extracción, y de la concentración del analito. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

98



La desviación de la exactitud por exceso se produce: › Cuando

existen interferencias y la selectividad del método no es adecuada, se obtienen resultados superiores al valor verdadero.



La desviación de la exactitud por defecto suele producirse cuando:

› La matriz de la muestra es compleja y la extracción del

analito requiere varios recuperaciones bajas.



pasos,

obteniéndose

Si la exactitud obtenida es repetible (precisión elevada) y además es homogénea en todos los niveles de concentración, puede aplicarse un factor de corrección en el cálculo final para compensar los resultados. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

99



Aplicación. › Determinación cuantitativa cuantificación de impurezas.



de

p.a.

y

Determinación. › La exactitud debe demostrarse en todo el rango especificado para el método, se debe realizar como mínimo 9 determinaciones, sobre 3 niveles de concentración (concentraciones nominal y en los extremos del rango). M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

100



Preparación de muestras. › Se prepara la matriz. Sobre la matriz se añaden cantidades conocidas del analito patrón a tres niveles de concentración dentro del rango a estudiar.

 

Realizar como mínimo 3 replicas para cada nivel (se tiene un total de 9 ensayos). Determinar el analito en cada muestra y calcular el porcentaje de recuperación.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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101



La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra.

%R 

X

m



100

 Xm = valor medio hallado.  µ = valor aceptado como verdadero M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

102



Se prepararon muestras con una concentración teórica mostrada a continuación: Concentración Teórica (%) Ensayo 1

Ensayo 2

Ensayo 3

Nivel 1

80

80

80

Nivel 2

100

100

100

Nivel 3

120

120

120

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

103



Después de la encontraron los experimentales:

determinación se siguientes valores

Concentración Experimental (%) Ensayo 1

Ensayo 2

Ensayo 3

Nivel 1

78,5

80,1

79,4

Nivel 2

100,5

100,2

100,7

Nivel 3

119,2

120,6

119,7

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

104



Primero, se debe determinar si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados. Se usa el test de Cochran de igualdad de varianzas para varios grupos muestrales del mismo tamaño. 2 2 2 s1  s2  ...  sK

G ex p 

s

2 m á xi m o 2 i

s

2 m á xi m o 2 2

s  2 s1  s  ...  s i2

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

105



Homogeneidad de varianzas. › Gexp = 0.5317 › G(0.05,k,n-1) = 0.8709 › Si Gexp < G(0.05,k,n-1), entonces se acepta la H0. › Existe homogeneidad de varianzas, el factor concentración no influye en los resultados.



Recuperación media. % R 

X

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

m



100

05/11/2012

106



Resultados Ensayo 1 (%)

Ensayo 2 (%) Ensayo 3 (%)

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Promedio =

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

CV (%) =

05/11/2012

107



Resultados Ensayo 1 (%)

Ensayo 2 (%) Ensayo 3 (%)

Nivel 1

98,1250

100,1250

99,2500

Nivel 2

100,5000

100,2000

100,7000

Nivel 3

99,3333

100,5000

99,7500

Promedio =

99,8315

CV (%) =

0,8211

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05/11/2012

108



Planteamiento de hipótesis.  H0 → Recuperación media = 100  H1 → Recuperación media ≠ 100

100  %R  n texp  CV  texp = 0.6157  t(0.05,n-1) = 2.306 

Exactitud adecuada. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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109

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

110



Precisión. › Expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de medidas a partir de una misma muestra homogénea. › La precisión engloba diferentes tipos de estudios: Repetibilidad, Precisión Intermedia y Reproducibilidad.



Repetibilidad. › Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (mismo analista, mismos aparatos y reactivos, etc.), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

111



Precisión Intermedia. › Estudia la variabilidad del método en una serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.



Reproducibilidad. › Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

112

El objetivo del estudio de precisión es conocer la variabilidad del método de ensayo.  Esta variabilidad se debe a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo.  Los factores que pueden influir sobre los resultados no pueden ser siempre controlados (analista, equipo, reactivos, tiempo, etc.), de ahí la importancia del estudio de precisión.  La precisión de un método analítico se expresa con el coeficiente de variación (CV) de una serie de medidas. 

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

113



Aplicación. › Para las determinación cuantitativa principios activos y cuantificación impurezas.



Determinación.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

114

de de



Repetibilidad Instrumental. › Estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento. 1. Se prepara suficiente cantidad de una muestra a concentración nominal que contenga sólo el analito. 2. Se realiza por lo menos 10 medidas consecutivas de la misma muestra (respuestas del instrumento). 3. Se determina el coeficiente de variación (CV) de las 10 medidas. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

05/11/2012

115



Repetibilidad del Método. › Determina la repetibilidad de todo el proceso de análisis (desde la pesada, preparación de la muestra hasta el resultado final del análisis). 1. Se prepara por lo menos 6 muestras por separado, a la concentración nominal, a partir de una muestra (analito + matriz) única homogénea. 2. Se realiza las medidas correspondientes y se determina el coeficiente de variación (CV).

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

Precisión intermedia. › Tiene como objetivo determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra, en un mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes (día, analista e instrumento). › Se prepara muestras independientes a concentración nominal (100 %) por triplicado, según la siguiente matriz. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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Instrumento

Analista Analista X

A Analista y Analista x B Analista y

Día 1

Día 2

Día 3

Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3

Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3

Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3 Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3

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

La evaluación estadística de la precisión se basa en la comparación de los CV% con datos estándar obtenidos de tablas. Intervalo de Aceptación (%) 98.5 – 101.5 97.0 – 103.0 95.0 – 105.0 90.0 – 110.0 85.0 – 115.0 75.0 – 125.0

CV (%) de Repetibilidad Método 0.58 1.16 1.94 3.88 5.81 9.69

CV (%) de Repetibilidad Instrumental 0.41 0.82 1.37 2.74 4.11 6.85

C V % Método  C V % Sistem a  2 M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Los resultados del estudio de repetibilidad instrumental para un p.a. con intervalo de aceptación de 95 – 105% son: 19.06 μg/ml (100%) Absorbancia a 511 nm 0.778 0.776 0.776 0.775 0.779 Promedio = s= CV (%) =

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0.779 0.776 0.780 0.777 0.777

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

La repetibilidad del método para un p.a. con intervalo de aceptación de 95 – 105% son: 19.06 μg/ml (100%) Absorbancia a 511 nm 0.778 0.777 0.771 0.791 0.782 0.787 Promedio = s= CV (%) =

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

Los resultados de precisión intermedia para el p.a. son: Analista

Analista X

Analista y

Absorbancia a 511 nm 9.53 μg/ml (50%) Día 1 Día 2 Día 3 0.787 0.795 0.769 0.771 0.802 0.778 0.782 0.796 0.768 0.777 0.785 0.771 0.77 0.806 0.777 0.781 0.782 0.782

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

La precisión intermedia es aceptable si su CV% es menor al doble del CV% del método.

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

Límite de Cuantificación. › Es la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas con una adecuada precisión y exactitud.



Límite de Detección. › Es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones experimentales. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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



Entre el LC y LD se encuentra un rango de concentraciones en el que, si bien no puede cuantificarse el analito con razonable certeza, si puede detectarse sin incurrir en falsos positivos. No deben confundirse con la sensibilidad, › Sensibilidad. Capacidad de un método para discriminar pequeñas diferencias en concentración o masa del analito. › La sensibilidad es la pendiente de la curva de calibración obtenida al representar la respuesta frente a la concentración. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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

Aplicación. › El LD, en la evaluación de impurezas mediante ensayos límite. › El LC, en métodos destinados a la determinación cuantitativa de impurezas. › Para métodos de análisis que se empleen en la determinación de impurezas o trazas de p.a. › Permite un mejor conocimiento del método, saber cuales son los LD y LC es útil en el ensayo de disolución, determinación de trazas de p.a. y en la validaciones de limpieza. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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El método propuesto esta basado en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero.  Se trata de un procedimiento aplicable a métodos analíticos Instrumentales que proporcionan resultados numéricos.  El procedimiento a seguir se describe a continuación. 

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

  

Se determinar la pendiente (b) de la curva de calibrado (Concentración vs. Respuesta) en el rango apropiado. Determinar una nueva curva de calibración a bajas concentraciones. Se prepara 3 muestras a concentraciones que se suponen cercanas al LC. Se realiza 3 replicas para cada concentración y se las analiza en las condiciones descritas en el método. M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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Pico B LC

Pico A LD Línea basal

ruido

Cromatograma que muestra el ruido de línea base M.Sc. JUAN JOSE QUISPE130 VARGAS de 69

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

La curva de calibración (rango 2.4 – 13.6 g inyectados) de un método analítico es representada por la siguientes ecuación.

y  857.6 x  27.9 



Se efectúan 3 mediciones por triplicado en la zona inferior de la curva para el cálculo de los LD y LC. Las áreas halladas son: M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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x (µg iny.) 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75

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y (Area) 242 254 230 460 465 447 671 667 679

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Ybl  10 Sbl  LC  b

Ybl  3 Sbl  LD b

› Ybl = Señal ruido. › Sbl = Desviación estándar de la señal ruido. › b = Pendiente de la recta del estudio de linealidad

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

Resultados de regresión lineal a bajas concentraciones.

y  860.67 x  26.89 › Ybl = a (ordenada al concentraciones). › Ybl = 26.89 (señal ruido).

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origen a bajas

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

Desviación estándar de la señal ruido (Sbl). x (µg) 0.25 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.75 0.75 0.75

y (Area) 242 254 230 460 465 447 671 667 679

Area Media

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s

X

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

Desviación estándar de la señal ruido (Sbl). x (µg) 0.25 0.25 0.25 0.5 0.5 0.5 0.75 0.75 0.75

y (Area) 242 254 230 460 465 447 671 667 679

Area Media

s

X

242

12

0.25

457.3333333 9.291573243

0.5

672.3333333 6.110100927

0.75

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

Regresión lineal (Concentración Desviación Estándar).

vs.

y  11.78 x  15.02 › Sbl = a (ordenada al origen de concentración vs. Desviación estándar). › Sbl = 15.02 (“s” de la señal ruido).

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Ybl  3 Sbl  LD b › LD = 0.084 µg.

Ybl  10 Sbl  LC  b

› LC = 0.206 µg.

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