UNMSM LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL PRACTICA DE BIOQUIMICA GENERAL AISLAMIENTO DE LECITINA - EMULSIFICACION DE GRA
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL
PRACTICA DE BIOQUIMICA GENERAL AISLAMIENTO DE LECITINA - EMULSIFICACION DE GRASAS HIDRÓLISIS DE GRASAS POR ACCION DE LIPASA PANCREATICA
INTRODUCCION
Las grasas más abundantes dentro de nuestra dieta son las llamadas grasas neutras, también conocidas como triglicéridos. Los triglicéridos constituyen la principal reserva energética del organismo animal como grasas y en los vegetales aceites. Además son buenos aislantes térmicos y dan protección mecánica. Sin embargo, el exceso de lípidos no solo es almacenado en los tejidos adiposos, sino que viajan a través de nuestra
organismo realiza diversas actividades como la hidrólisis y emulsificación de las mismas. El objetivo de esta práctica es conocer tanto las vías de degradación de los triglicéridos a partir de enzimas del tracto digestivo como el aislamiento de la lecitina, ejemplo importante, cuyo procedimiento puede ser interpolado con el aislamiento de otros fosfolípidos.
PRACTICA Nº 5: AISLAMIENTO DE LECITINA. EMULSIFICACION E HIDRÓLISIS DE GRASAS
sangre, depositándose en lugares no apropiados. Para evitar el exceso de grasa, el
DIGESTION DE LAS GRASAS
I.
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MARCO TEORICO
1. AISLAMIENTO DE LECITINA La lecitina es también fosfatidilcolina o polienilfosfatidilcolina, es uno de los principales constituyentes de las bicapas lipídicas de las membranas celulares y también es un fosfolípido que, junto con las sales biliares, ayuda a la solubilización de los ácidos biliares en la bilis.
La bilis es una sustancia formada por colesterol, bilirrubina y lecitina entre otras sustancias, es sintetizada por el hígado y vertida al intestino delgado a través de un conducto denominado colédoco. Tiene una gran importancia en la digestión ya que se encarga de emulsionar los lípidos que ingerimos en la dieta.
DETERGENTE DE LAS GRASAS LECITINA Este nutriente ayuda a proteger los órganos y las arterias de la acumulación de grasa, mejora el funcionamiento del cerebro y facilita la absorción de algunas vitaminas del complejo B y de la vitamina A. Promueve la reducción de los niveles de colesterol y triglicéridos en la sangre. La fosfatidilcolina o lecitina es producida naturalmente por el hígado y se puede obtener de ciertos productos alimenticios, principalmente la soja y la yema del huevo.
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II.
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL 2. EMULSIFICACION DE GRASAS El proceso de digestión de grasas empieza a nivel del estómago. Una pequeña cantidad de triglicéridos es digerida hasta en un 10% por la Lipasa Lingual, una enzima producida en la boca y transportada en la saliva al estómago, para luego pasar al intestino delgado. El intestino delgado se encarga de la emulsificación de las grasas. La grasa no digerida se encuentra a nivel intestinal como grandes gotas, producto del movimiento del alimento en el estomago, las cuales deben ser fragmentadas en partes más pequeñas con la finalidad de que enzimas digestivas hidrosolubles puedan actuar sobre las mismas, alcanzando su objetivo final por acción de la bilis. La bilis no contiene enzimas digestivas, pero si grandes cantidades de sales biliares así como lecitina.
Este proceso hace que las gotas de grasa reduzcan su tensión superficial, y al ser agitadas en el intestino delgado se fragmenten
de las gotas de grasa se reducen por la fragmentación y la agitación en el intestino delgado, la superficie de grasa aumenta.
La bilis posee una función adicional además de la emulsificación. En una concentración suficiente las sales biliares tienen la propiedad de formar las llamadas micelas. Las micelas son gotas esféricas y cilíndricas de tres a seis nanómetros de diámetro compuestas de 20 a 40 moléculas de sales biliares.
Las micelas actúan también como un medio de transporte de ácidos grasos libres y monogliceridos para su posterior absorción en el borde en cepillo de las células epiteliales intestinales.
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fácilmente. Pero debemos recordar que a medida que los diámetros
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3. HIDRÓLISIS DE TRIGLICERIDOS
La digestión de las grasas comprende la hidrólisis de los triglicéridos a ácidos grasos libres y glicerol para que puedan ser captados por las células. La lipasa es una enzima que se usa en el organismo para disgregar las grasas de los alimentos de manera que se puedan absorber. La mayoría de las lipasas del organismo se sintetiza en el páncreas, aunque una parte se secreta también en la saliva. La pancreatina (HPL) contiene lipasa y otros dos grupos de enzimas: proteasas y amilasa. Este proceso comienza en el estómago, mediante la lipasa gástrica que es secretada por las células principales que también secretan pepsina. La lipasa
que el páncreas no funcione en más de un 70%, la grasa no se absorbe.
ACCION DE LA LIPASA
GRASA
ACIDO GRASO
GLICEROL
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pancreática es esencial para la absorción normal de las grasas, pues en casos en
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DISCUSIÓN Y RESULTADOS
EXPERIENCIA Nº 1: Aislamiento de Lecitina
1. Resultados y Discusión
Al cabo de aproximadamente una hora, podemos observar un precipitado blanquecino, que
es
la
fosofaidilcolina
(lecitina). La
fosfatidilcolina se precipita debido a que el coeficiente dieléctrico de la acetona es menor que el del etanol, es decir que la acetona es menos polar que el etanol. Es por eso que en el alcohol no se observaba precipitado y en la acetona sí.
EXPERIENCIA Nº 2: Emulsificación de Grasas
1. Resultados - Luego de realizado el experimento, procedemos a elaborar la siguiente tabla en base a la característica “mayor presencia de micelas” de forma descendiente. La tabla se muestra a continuación.
Número de tubo
Reactivo
2
Sol. Sales biliares
4
Sol. Jabón
3
Sol. Proteína
6
Sol. Lecitina
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III.
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Bicarbonato
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Agua destilada
2. Discusión - La solución incolora del tubo 02 con sales biliares, indica una mayor presencia de micelas pequeñas y muy continuas entre sí; esto demuestra que la
secreción biliar es necesaria para la emulsificación de las grasas y
formación de micelas, para su próxima absorción.
polares y apolares, logró separar al aceite en una fase dispersa; el número de gotas es semejante a las aparecidas en tubo 02. Se observa que las gotas tienden a agruparse con el fin de aumentar su tamaño y disminuir la tensión superficial. - Con la solución de proteínas y lecitina, la formación de micelas se observa en menor cantidad, pero a su vez éstas son más pequeñas, aunque aún manifiestan cierta tendencia a la agrupación. - Los resultados obtenidos en la solución de bicarbonato mostraron la presencia de micelas pequeños en comparación a los anteriores, la fase líquida no estaba totalmente ocupada por las micelas, lo que demuestra que la prevención de coalescencia esta en un nivel intermedio. - Finalmente, el tubo 01 es el típico caso de agua y aceite. Lo que se puede observar es que las micelas solo están presentes los primeros segundos luego de la agitación. Su tamaño es de regular a pequeño y desaparecen en cuanto la fase líquida recobra su estabilidad (no movimiento). Son casi imperceptibles.
EXPERIENCIA Nº 3: Hidrólisis de triglicéridos por acción de Lipasa
1. Resultados
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- En el tubo 04, la presencia del jabón, que contiene una mezcla de grupos
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL En esta experiencia demostraremos in vitro la acción de la enzima lipasa, la cual tiene la función de degradar las grasas a glicerina y ácidos grasos. La formación de ácidos grasos libres en nuestros tubos de ensayo se evidenciara a la hora de titularlos con NaOH 0.01N, ya que estos ácidos grasos deben de disminuir el pH (aumentar la acidez) de la solución. Para ello, utilizamos tres tubos de ensayo, en los cuales vertimos lo componentes de esta manera:
B
Buffer pH 8 (2ml)
1
Sustrato – aceite neutralizado (1ml)
Sales biliares (2ml) Buffer pH 8 (2ml) Agua destilada (1ml)
Lipasa pancreática (1ml)
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Sustrato – aceite neutralizado (1ml) Sales biliares (2ml) Agua destilada (1ml) Lipasa pancreática (1ml)
*Las sales biliares que se administraron a dos de los tubos sirve para activar la lipasa. Una vez incubados por 40 minutos, se obtuvo la siguiente imagen:
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Agua destilada (1ml)
Lipasa pancreática (1ml)
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Donde se muestra, en algunos, formación de precipitado (2fases) como resultado de la acción de la lipasa sobre las moléculas de grasas que componen el aceite. La fase menos densa vendría a ser los ácidos grasos. La
- En el tubo B, se observa una fase homogénea ya que no se administro el sustrato sobre el que actúa la enzima. - Para el tubo 1 se administro sustrato y la enzima pero no sales biliares, lo que no contribuye a la activación de la lipasa. Así que el tubo 1 puede mostrar un pequeño porcentaje de actividad enzimática pero no mas, pues no hay agente que active la enzima. Es decir, una pequeña diferenciación de fases. - En el tubo 2, se encuentran presentes el sustrato y la enzima, así como el activador de esta (las sales biliares). De esta forma, la actividad enzimática es grande; se pueden observar 2 fases muy marcadas y gruesas. Para corroborar la acción de la enzima procedemos a calcular la acidez de las muestras contenida en cada uno de los tubos. Para ello vaciamos en contenido de estos en vasos descartables y añadimos fenolftaleína de acuerdo a la cantidad indicada en clase. Con ayuda de una bureta con NaOH 0.01N y un soporte, titulamos. Obtuvimos los siguientes resultados: B
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fase más densa que precipita, seria la glicerina.
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL Normalidad de la base
0.01 N
0.01 N
0.01 N
Volumen de la base
0.3 ml
0.45 ml
0.4 ml
Volumen del acido
6 ml
6 ml
6 ml
Determinamos la concentración de la muestra (acido), y luego con esta el
𝑁𝑏𝑎𝑠𝑒 × 𝑉𝑏𝑎𝑠𝑒 = 𝑁á𝑐𝑖𝑑𝑜 × 𝑉á𝑐𝑖𝑑𝑜 - Tubo B:
𝑁𝐵 =
0.01 ×0.3 6
= 0.0005
𝑝𝐻 = − log[𝐻] = − log[𝑁𝐵 ] = 3.30 - Tubo 1:
𝑁1 =
0.01 ×0.4 6
= 0.00067
𝑝𝐻 = − log[𝐻] = − log[𝑁1 ] = 3.18 - Tubo 2:
𝑁2 =
0.01 ×0.6 6
= 0.001
𝑝𝐻 = − log[𝐻] = − log[𝑁2 ] = 3 Tal como lo habíamos previsto: - El tubo B presenta una menor acidez que el tubo1, y este a su vez una acidez menor que la del tubo2. Esto se debe a que en el tubo 2 esta actuando en forma activa y continua la lipasa produciendo una gran cantidad de ácidos grasos libres los cuales ocasionan una disminución del nivel de pH.
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pH de a muestra presente en cada tubo:
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LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL - El tubo uno al contener la enzima, de seguro logro actuar por su cuenta sin necesidad de la activación por el acido biliar, pero de esta manera su actividad no es rápida y apenas debe de haber llagado a utilizar las pocas enzimas activas que tenia (ayudado por la temperatura y el pH del buffer para el medio). - El tubo B no tuvo reacción alguna a pesar de la presencia de lipasa pues no se encontraban los lípidos a los que tenía que hidrolizar. Aquí el orden de acidez de la muestra contenida en cada tubo:
IV.
BIBLIOGRAFIA -
Bioquímica. Stryer, Lubert; Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L. Edicion; 5 Capitulo: 12
-
Principios de Bioquimica. Lehninger, Albert L. Capitulo 13.
-
http://cbi.izt.uam.mx/iq/Laboratorio%20de%20Operaciones%20Unitarias/Prac ticas%20Laboratorios/PRACTICA2.pdf
-
file:///C:/Documents%20and%20Settings/clases/Escritorio/Hidrolisis%20de%2 0grasas%20-%20Tesis%20y%20monograf%C3%ADas.htm
PRACTICA Nº 5: AISLAMIENTO DE LECITINA. EMULSIFICACION E HIDRÓLISIS DE GRASAS
𝑡𝑢𝑏𝑜 𝐵 < 𝑡𝑢𝑏𝑜 1 < 𝑡𝑢𝑏𝑜2
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