Instituto Tecnológico de Veracruz Dpto. Ing. Química e Ing. Bioquímica Cinética Química y Biológica Cinética Enzimática
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Instituto Tecnológico de Veracruz Dpto. Ing. Química e Ing. Bioquímica Cinética Química y Biológica
Cinética Enzimática
14 de mayo del 2012
Cinética Química y Biológica: Cinética enzimática
Mayo 2012
Obtención de la próteasa Actinidina a partir del kiwi
Contenido Introducción ................................................................................................................................ 3
1. 2.
Objetivos ................................................................................................................................. 3
3.
Fundamento teórico ................................................................................................................. 4
3.1
Cinética Enzimática............................................................................................................. 4
3.2
Proteasas sulfhídricas .......................................................................................................... 4
3.3
Actinidina ............................................................................................................................ 5
3.3 Fruto .......................................................................................................................................... 5 3.3.1Propiedades Nutritivas ............................................................................................................ 5 4.
Metodología ................................................................................................................................ 9
Conclusiones ..................................................................................................................................... 11 Bibliografía ........................................................................................................................................ 11
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1. Introducción
El presente trabajo pretende servir de protocolo en el desarrollo de una posterior práctica para la unidad de Cinética Enzimática del curso de Cinética Química y Biológica de la carrera de Ingeniería Bioquímica, la cual tiene la finalidad de extraer de una enzima a partir de una fruta. Con esto además se busca determinar los diferentes parámetros incluidos en una cinética enzimática. La elección del sustrato fue de acuerdo a las posibilidades efectivas de hallarlo y poder trabajar con el mismo. Las frutas crudas son portadoras de enzimas proteolíticas y al ser una fruta de fácil obtención, en mercados locales, y conservación, fue elegida como el sustrato para la extracción de la proteasa. Además en vista de la importancia de las proteasas en procesos como el digestivo, la selección de la actinidina por su naturaleza proteasa resulta interesante desde el punto de vista de una sana alimentación.
2. Objetivos Objetivo general:
Objetivos específicos
Extraer la proteasa actinidina del fruto del kiwi (Actinidia deliciosa)
Definir y determinar la actividad enzimática como U/mL para la actinidina aislada
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3. Fundamento teórico Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Aunque las reacciones enzimáticas obedecen a los mismos principios de la cinética química, se diferencian de éstas por el hecho de que las enzimas son saturadas por los sustratos. (Mathews, Van Holde, & Ahern, 2002)
3.1 Cinética Enzimática El enfoque central para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente es para determinar la velocidad de la reacción y como cambia en respuesta a cambios en parámetros experimentales, una disciplina conocida como cinética enzimática (Lehninger Nelson & M. Cox, 2005)
3.2 Proteasas sulfhídricas Comprenden a un grupo de enzimas, en las cuales su actividad proteolítica depende de un grupo sulfhidrilo de un resido de cisteína en su sitio activo. Este tipo de enzimas e encuentra ampliamente distribuido en diferentes especies de animales, vegetales y bacterias. Hay evidencia de que la mayoría de ellas pertenecen a una familia de enzimas que presentan homología, tanto estructural como funcional. Glazar & Smith, citado Alvarez, 1992) Las proteasas sulfhídricas más conocidas son las de origen vegetal, ya que dichas fuentes se obtienen con relativa facilidad y en cantidades considerables. Este tipo de proteasas es ampliamente utilizado en la industria, por ejemplo en el ablandamiento de carnes y clarificación de cerveza, su función metaólica sugiere que en lo vegetales actúan como agentes proteolíticos contra infecciones fúngicas. (Baker & Drenth, citado en Alvarez, 1992). Existe una gran variedad ed proteasas sulfhidrílicas caracterizadas por sus masas moleclares y por ss puntos isoeéctricos, casi todas estas enzimas tienen masas moleculares enre 20 000 y 33 000 Da. Su puntos isolectrocios son muy variables lo que probablemente se debe a los diferentes medio biologicos en los cuales actuan. (Alvarez, 1992)
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3.3 Actinidina El nombre científico de la actinidia, que pertenece a la familia delas Actinidiáceas , un género de plantas de árboles nativos del este templado de Asia, China, Corea y Japón, extendiéndose a Siberia sr oriental y en el sur de Indochina. El genero incluye arbustos con 6 metros de altura y vides vigorosas de hasta 30 meros.
3.3 Fruto El kiwi procede de una planta trepadora que recibe su mismo nombre y pertenece a la familia de las Actinidiáceas, que incluye unos 300 árboles y arbustos,
muchos
de
ellos
trepadores
y
ornamentales propios del hemisferio sur. A pesar de su aspecto externo poco atractivo, se trata de un fruto muy sabroso y de interesantes propiedades Ilustración 1. Arbol de Kiwi nutritivas.
3.3.1Propiedades Nutritivas Su componente mayoritario es el agua. Es de moderado aporte calórico, por su cantidad de carbohidratos. Destaca su contenido en vitamina C; más del doble que una naranja, y vitaminas del grupo B, entre ellas el ácido fólico. Así mismo es rico en minerales como potasio, magnesio y fibra, soluble e Ilustración 2. Un fruto de kiwi por mitad
insoluble, con un potente efecto laxante. La fibra mejora el tránsito intestinal. La vitamina C interviene
en la formación de colágeno, huesos y dientes, glóbulos rojos y favorece la absorción del hierro de los alimentos y la resistencia a las infecciones. El ácido fólico colabora en la producción de glóbulos rojos y blancos, en la síntesis material genético y la formación anticuerpos del sistema inmunológico. El magnesio se relaciona con el funcionamiento de Instituto Tecnológico de Veracruz. Dpto. Ing. Química e Ing.Bioquímica
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intestino, nervios y músculos, forma parte de huesos y dientes, mejora la inmunidad y posee un suave efecto laxante. El potasio es necesario para la transmisión y generación del impulso nervioso, para la actividad muscular normal e interviene en el equilibrio de agua dentro y fuera de la célula.
Tabla 1. Composición del fruto fresco de actinidia (Arandia, 1998)
El kiwi es una fruta muy adecuada para realizar una buena digestión porque contiene
una
enzima
proteolítica
llamada actinidina y, tal como ocurre con la bromelina de la piña, o la ficina de los higos, resulta muy interesante en la alimentación porque ayuda a disolver las proteínas y favorece la digestión, Ilustración 3. Actinidina
evitando la indigestión, la gastritis o la formación de gases.
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Por otra parte, esta proteína hace que el kiwi sea muy difícil de combinar con productos que contienen leche o gelatina hechos que no se vayan a consumir pronto. La actinidina destruye las proteínas de la leche y de la gelatina, por lo que los productos que contienen esto se harán blandos en poco tiempo o no endurecerán. (Botanical online, 1999). El calor, como en muchas otras enzimas, desnaturaliza la estructura terciaria perdiendo su actividad catalítica en éste caso proteolítica. En sistema gastrointestinal humano, las enzimas proteolíticas funcionan cortando las largas cadenas de aminoácidos complejos que componen las proteínas presentes en los alimentos en cadenas más cortas, los aminoácidos más simples que luego pueden pasar a las células que recubren el intestino delgado, donde son procesados en combustible para proporcionar al cuerpo algunos de los ingredientes necesarios para el crecimiento y producción de energía. La digestión es el conjunto complejo de procesos biológicos por el cual el cuerpo convierte los alimentos en combustible. Entre más eficiente la digestión, más energía del cuerpo se deriva de una cantidad dada de alimentos. Sólo los alimentos crudos contienen enzimas activas. El proceso de cocción de alimentos desnaturaliza a
la mayoría de las enzimas. Un
cuerpo sano produce la mayor parte, pero no todas las enzimas que necesita para la digestión eficiente. El balance se deriva de los alimentos que comemos. Para evitar que el cuerpo tome en exceso la enzima a
través
del
suministro
de
alimentos,
hay
mecanismos que operan para controlar la actividad Ilustración 4. Aparato digestivo humano de las enzimas introducidas en el suministro de alimentos. Estos mecanismos funcionan como inhibidores de la enzima. (Donaldson, 2004)
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Una serie de composiciones de tipo digestivos / laxante son conocidos, muchos de los cuales se basan en materiales sintéticos o compuestos. Es posible en al menos una parte de estos casos, para que haya incompatibilidades o conflictos entre los medicamentos - en el escenario menos grave este puede ser simplemente una reducción en la eficacia de uno de los medicamentos. En un escenario más grave, la salud del usuario podría verse comprometida. (Donaldson, 2004) Es por esto que se buscan alternativas para el tratamiento del proceso digestivo lento, siendo la actinidina una opción viable.
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Metodología
El método para preparar una composición digestiva/laxativa, incluye los pasos de: 1. Pulpeo de la fruta del genero actinidina 2. Clarificado del material pulpeado. Realizado utilizando metodología centrífuga o alternativamente una metodología de concentración y congelación. 3. Liofilización subsecuente del material pulpeado El proceso se lleva a cabo a temperatura y/o condiciones las cuales no resultan en una degradación significante de la actinidina. La temperatura no debe de superar los 40°C y la proporción de actinidina en el producto resultante no debe caer por debajo del 1% en peso, y cerca del 10 al 20%. El gel enriquecido con enzima fue probado para su actividad colocando un poco en una pieza de película de rayos X sin revelar. El líquido removió la capa de color púrpura de la película exponiendo el celuloide subyacente. El gel fue puesto en piezas de pan y después comido. El pan claramente poseía similares características digestivas que la pulpa de kiwi fresca. Fue por lo tanto concluido que la enzima actidina es en hecho el ingrediente activo en lugar de fibra en la dieta como se pensaba inicialmente. De los ensayos posteriores fue posible estimar el rendimiento de actidina entre 50 y 150 grs de pulpa de kiwi fresca para desencadenar un efecto digestivo positivo y/o mecanismo regulatorio en la media adulta. (Donaldson, 2004)
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La actinidina fue inicalmente aislada a partir del jugo
Pulpa de fruta de wiki diluida + Metabisulfito de Na a 150 ppm
Tela de prensado +Pectinasa 100 ppm
+Auxiliar de filtrado de celulosa 2% (w/v)
Jugo clarificado
Jugo sin clarificar
Centrifuga NaCl 25% (w/v)
Precipitación
Solución de extracción
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Gel enriquecido de enzima
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Conclusiones
A través de este trabajo pudimos ver como se desarrolla una cinética enzimática, además de conocer un proceso de extracción de enzima a partir de una fruta cruda, las propiedades de la fruta y el mecanismo de la enzima.
Bibliografía Botanical online. (1999). Recuperado el 1 de Mayo de 2012, de El mundo de las plantas: http://www.botanical-online.com/kiwispropiedades.htm Alvarez, M. C. (1992). Aislamiento y purificación de actinidin de Actinidia chinesis. México: UNAM. Arandia, E. R. (1998). Efecto del pH en la actividad y conformación de la actinidina del fruto del kiwi (Actinidia chinensis). Mexico: UNAM. Bozzola, C., Ivancevich, J., Kriunis, I., & Tassielo, E. (2010). Alergia al kiwi. Recuperado el 12 de mayo de 2012, de Alergia a alimentos: www.alergialimentaria.org/alergenos/alergeno_wiki.pdf Bruce William Donaldson, A. (2004). Patente nº US20040058025A1. Estados Unidos . Donaldson, B. W. (2004). Patente nº USA20040058025A1. United States. Lehninger Nelson, D., & M. Cox, M. (2005). Principles of Biochemistry. U. de Wisconsin, Madison: W. H. Freeman. Lehninger, D., & Cox, M. M. (2005). Principles of Biochemistry. U. de Wisconsin, Madison: W. H. Freeman. Mathews, C. K., Van Holde, K., & Ahern, K. G. (2002). Bioquímica. Madrid: Pearson Educación.
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