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• Luisa Catceres

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El Splicing Dr. Alfonso C. Martínez-Conde Ibáñez

Genética Molecular Humana

PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN. ES PROPIEDAD DE LAB314.COM

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Medicina Universidad Complutense de Madrid. Curso 2018 - 2019 Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

En la Región Codificadora del gen se alternan exones e intrones. En el transcrito primario también aparecerán exones e intrones. Casi todos los genes humanos de la clase 2 tienen exones e intrones. Su existencia permite que cada gen codifique para más de un mRNA y por lo tanto para varias proteínas diferentes (isoformas proteicas o isoproteínas). +1

E

I

E

I

E

I

E

I

E

E

I

E

I

E

I

E

I

E

Transcrito Primario Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

La región codificadora de todos los genes empieza en el start site, que es también la primera base del primer exón (E1) y termina en un exón. Por ello, el número de exones supera en la unidad al número de intrones. Tanto los exones como los intrones se numeran consecutivamente (E1, E2, E3, E4, E5 …. e I1, I2, I3, I4 …). +1

E1

I1

E2

I2

E3

I3

E4

I4

E5

GEN / DNA

E1

I1

E2

I2

E3

I3

E4

I4

E5

Transcrito Primario / RNA Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

La cola Poly (A) es estabilizada mientras está en el nucleo por la proteína PABP 2. Los transcritos forman complejos denominados hnRNPs al unirse a un grupo de más de 20 proteínas diferentes denominadas HNRNPs.

HNRNPs

PABP 2

Algunas HNRNPs: HNRNPA0, HNRNPA1, HNRNPL, HNRNP, HNRNPQ,HNRNPR, HNRNPU, HNRNPC, HNRNPAB, HNRNPM, HNRNPK. Las HNRNPs van a dirigir procesos específicos de splicing alternativo y de RNA editing

Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

INTRONES U2 La estructura de un intron típico denominado tipo U2 es la que vemos a continuación. Empiezan con un par 5´ GT para el DNA (GU para el RNA) y terminan con un par 3´ AG. Cerca del extremo 3´ tienen una secuencia rica en bases pirimidínicas y upstream de esta secuencia pirimidínica está el branch point que consiste en una A en una secuencia consenso.

INTRÓN TIPO U2 EXÓN

EXÓN

AG GTRAGT

5´

GT

CTRACT

Branch point

Y(n)

YAG G

Pirimidinas AG

3´

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El spliceosoma U2 está formados por 5 snRNPs y la proteína asociada a U2 denominada U2AF que se asocian al hnRNA. Las snRNPs U1, U2, U4, U5 y U6 están formadas por snRNAs y varias subunidades proteicas. Los Spliceosomas están constituidos por unas 80 subunidades proteicas.

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I

GU

A +U1

I

U1

U2

+U4

+U2 +U2AF

II

U2AF

+U5

II

AG

+U6

I

I U2

U2AF

II U2AF

II

U2

U1

U4 U1 U6

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Segunda Transesterificación

INTRÓN TIPO U2 EXÓN

EXÓN

AG GTRAGT

CTRACT

Y(n)

YAG G

Primera Transesterificación Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

La primera transesterificación se realiza entre el enlace fosfodiester C3´ – P – C5´ de la unión Exón I - Intrón I y el C2´OH de la Adenosina del Branch Point.

I

C3´-

P

- C5´

A

C3´-

P

- C5´

II

C3´-

P

- C5´

II

OH

I

C3´-

OH

A P C5´

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La segunda transesterificación se realiza entre el enlace fosfodiester C3´ – P – C5´ de la unión Intrón I – Exón II y el C3´OH del Exón I.

I

C3´-

A

OH

C3´-

P

- C5´

II

A

C3´-

P C5´

I

C3´-

P

- C5´

II

OH

P C5´

lariat

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Por otro lado, aunque el spliceosoma U2 es el más abundante en humano, existe otro tipo de spliceosomas, que recibe el nombre de U12,

I

I U2AF

II

U2

U12U6atac

II

U4atac

U4 U1

U11

U6

Spliceosoma U2

Spliceosoma U12 Comparten la snurp U5

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Existe una clasificación de los intrones en varios grupos (I, II, III y nucleares o IV) que se refiere al conjunto de los organismos vivos. Esta clasificación no tiene ninguna utilidad en humano, por diferentes motivos. Por un lado, el DNA mitocondrial humano carece de intrones. En los genes nucleares de la clase III codificadores de los tRNAS existen intrones en algunas de las secuencias de tRNA, pero son eliminados por procesos enzimáticos sin el auxilio de spliceosomas. Los intrones de los genes de la clase 2 eran considerados estructuralmente uniformes, pero actualmente se reconocen varios tipos. Tras el intron “común” denominado U2 ( GT – AG) se encontró un tipo de intron reconocido por el spliceosoma U12 o intron AT – AC.

Intron U2

Intron U12

AG GTRAGT

ATATCCTTT

CTRACT

TCCTTAACT

Y(n)

YAG G

YAC G

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Sin embargo, como se observa en el dibujo, estos intrones se diferencian en otros aspectos estructurales. Actualmente sabemos que existe otro tipo de intron cortado por U12 en que los pares 5´y 3´ son GT y AG. Por ello hablamos de U12atac y U12gtag. A esto hay que añadir la existencia de intrones con estructura tipo U2 en que los pares 5´y 3´ son AT y AC.

Intron U2

AG GTRAGT

CTRACT

Y(n)

YAG G

Intron U12gtag

GTATCCTTT

TCCTTAACT

YAG G

Intron U12atac

ATATCCTTT

TCCTTAACT

YAC G

Esto hace que se pueda hablar de dos tipos de intrones, caracterizados por mecanismos de splicing diferentes ( U2 y U12 ) que reconocen secuencias conservadas.

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Podemos ver los diferentes tipos de intrones en genes humanos de la clase 2 que se conocen, si accedemos a una base de datos de intrones: http://genome.imim.es/cgi-bin/u12db/u12db.cgi

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Podemos ver los diferentes tipos de intrones en genes humanos de la clase 2 que se conocen, si accedemos a una base de datos de intrones: http://genome.imim.es/cgi-bin/u12db/u12db.cgi

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Podemos ver los diferentes tipos de intrones en genes humanos de la clase 2 que se conocen, si accedemos a una base de datos de intrones: http://genome.imim.es/cgi-bin/u12db/u12db.cgi

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TSS E2

E1

E3

E4

E5

E4

E5

GEN GENÓMICO

TSS E2

E1

E3 TRANSCRITO PRIMARIO

TSS PolyA

+

mRNA AUG

UAA, UAG, UGA

TSS 5´ UTR

CDS / ORF

3´ UTR

PolyA

mRNA CADENA POLIPEPTÍDICA Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid. © Prohibida la copia total o parcial

AUG

UAA, UAG, UGA

TSS 5´ UTR

CDS / ORF

3´ UTR

PolyA

mRNA CADENA POLIPEPTÍDICA

El ORFoma es el conjunto de CDSs / ORFs de la especie. En la página de la Universidad de Harvard dedicada a ello podemos encontrar una base de hORFs completos de unos 10,000 genes con multiples splicing variantes: http://horfdb.dfci.harvard.edu/index.php?page=toolsdata. Veamos una ORF. Por ejemplo la ORF de la variante 2 del gen de la hGH: Escribimos GH2 en la caja: http://horfdb.dfci.harvard.edu/index.php?page=orfsearch y vemos que nos proporciona una ORF de 654 nucleotidos que comienza por ATG (triplete start) y termina con TAG (triplete stop).

Si tenemos un mRNA (cDNA) podemos buscar su ORF mediante un programa adecuado como el ORF Finder.

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