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BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURA Brenda Natalia Londoño Vélez 1240117, Oscar Eduardo Polania 1236096 Universidad del Valle Programa de Biología Laboratorio de bioquímica y biología celular II Santiago de Cali, Colombia [email protected]; [email protected] Resumen Las levaduras (Saccharomyces cerevisiae) son hongos unicelulares no filamentosos, con una morfología característica esférica u ovalada. Estos organismos son heterótrofos, que tienen la capacidad de crecer como organismos anaerobios facultativos o aerobios. En su mitocondria se produce el ATP que utilizan para realizar sus funciones metabólicas, el objetivo de la práctica es comprobar la existencia de un bombeo de Iones H+ hacia el medio extracelular, para verificar esto, a la célula de levadura se le realizaron mediciones del pH extracelular al agregar un nutriente como la glucosa y otros compuestos como el 2,4 dinitrofenol (DNP) y la azida de sodio, siendo el DNP el desacoplante y la azida de sodio el inhibidor, la prueba control del experimento fue las levaduras con la glucosa y así lograr establecer una relación entre el trabajo realizado por las enzimas en su estado natural, encontrando así una ∆pH= 0,78 y un ∆H+= 0,1659 que se obtuvo al realizar la diferencia entre el pH del estado basal y el pH del estado final, luego se realizo la misma prueba y esta vez se le agrego 2,4-dinitrofenol y así observar la acción desacoplante que este tiene sobre la levadura y obteniendo ∆pH=0,27y un ∆H+=0,537, y finalmente se analizo el efecto inhibidor que tiene la azida de sodio sobre las levaduras y esta dio como resultado una ∆pH=0,51 y un ∆H+=0,309, Con estos datos se logro establecer una relación entre bombeo de protones y el ingreso de glucosa para generar de energía metabólica, en conclusión el efecto que tiene el DNP es de desacoplante y azida de sodio inhibidor en los procesos como la respiración celular, el transporte de protones y la producción de energía en forma de ATP. Palabras claves: ATP, levaduras, metabolismo, 2,4dinitrofenol (DNP) desacoplante, azida de sodio (inhibidor), pH Introducción Las levaduras tienen un sistema para bombear protones al exterior, y ello resulta de la generación de un potencial eléctrico, negativo en el interior. Por esta razón el K+, un catión se ve atraído al interior de tal manera que, con la sola presencia de un sistema de transporte que facilite su entrada, puede traspasar la membrana y acumularse con mayor concentración que afuera.

Las investigaciones que se realizaron fundamentalmente en los cincuentas por Conway, estimularon el desarrollo de la hipótesis quimiosmótica. Durante muchos años se buscó un intermediario químico que acoplara la oxidación metabólica con la síntesis de ATP. Posteriormente Mitchell en 1961, postuló su hipótesis quimiosmótica con el propósito de explicar los mecanismos de conservación de energía y el transporte de iones en los sistemas vivos. Como consecuencia, Mitchell sugirió que el único intermediario en la fosforilación oxidativa era un gradiente de protones creado a través de la membrana. La idea central de la hipótesis establece que la cadena transportadora de electrones de las mitocondria o bacterias está acoplada a la síntesis de ATP mediante un potencial electroquímico de protones, el cual crea a través de las membranas trasductoras de energía y es necesario también para mover los iones al interior de las membranas de las mitocondrias o bacterias, en contra de un gradiente de concentración químico mediante sistema de transporte específico. De acuerdo con esta teoría, los sistemas de transporte de electrones pueden ser sistemas de transposición primaria o bombas, que proporcionan energía con que opera una ATP sintetasa para generar ATP de la célula. Los experimentos en levadura y la teoría de Mitchell condujeron al planteamiento de la existencia de una bomba de protones en la membrana plasmática. Posteriormente se llevaron a cabo experimentos con desacoplantes y se observó que el efecto de los mismos dependía de la dirección de los gradientes combinados de H+ y K+ o del potencial electroquímico de la célula y de acuerdo con la capacidad reportada para conducir protones a través de la membrana, demostró la existencia de una bomba de protones (ATP asa), responsable de crear el potencial electroquímico que involucra el transporte de potasio de una forma acoplada pero independiente, acorde a lo escrito por la hipótesis quimiosmótica. La bomba de protones de la membrana plasmática dirige funciones fisiológicas que son vitales para la levadura, y por esto, se espera que su actividad sea fuertemente regulada por diversos factores, como lo reportan algunas investigaciones que han observado la hiperpolarización de las células de levadura, cuando se preincuban con glucosa, o inducción de un estado activado de la ATPasa de membrana plasmática por este sustrato. La práctica se llevó a cabo con el propósito de comprobar la existencia de dicho bombeo de protones de la levadura hacia el medio extracelular, establecer una relación entre el bombeo de protones y el transporte de nutrientes y la generación de energía metabólica.

Resultados Se midió la diferencia del pH extracelular de la levadura con 3 compuestos: glucosa, 2,4dinitrofenol y azida de sodio. Se determinó ∆pH de los 3 compuestos entre el estado basal y el estado final, el ∆pH=0,78 de solo la glucosa fue mayor que el ∆pH de las otras 2 mezclas: glucosa+2,4-DNP con un ∆pH= 0,27 y glucosa + azida de sodio con un ∆pH= 0,51

Tabla No 1. Diferencia del pH de glucosa, 2,4-DNP y azida de sodio en diferentes intervalos de tiempo.

Tiempo (min) 0 3 6 11 16 21 26 31 41 51 ∆pH ∆H+

Glucosa pH 4,73 4,43 4,41 4,26 4,05 3,92 3,83 3,77 3,69 3,63 0,78 0,1659

2,4 -dinitrofenol pH 4,24 4,36 4,43 4,44 4,37 4,31 4,27 4,25 4,2 4,16 0,27 0,537

Azida de sodio pH 5,12 5,28 5,36 5,13 5,01 4,99 4,98 4,94 4,86 4,85 0,51 0,309

pH 5.5

5

glucosa 4.5

2,4 - DNF Azida de sodio

4

3.5 0

10

20

30

40

50

Tiempo (minutos)

Figura No 1.Gráfico en el cual se compara el cambio de pH a medida que pasa el tiempo para soluciones que contienen glucosa, glucosa + 2,4-DNP y glucosa + azida de sodio se realizó el cálculo del cambio de pH en la glucosa, con el propósito de obtener control, para así lograr comparar con los resultados obtenidos del cambio de pH de las dos mezclas (glucosa+2,4-DNP, glucosa+ azida de sodio), estos cambios de pH se logran registrar en la levadura por las dos mezclas es debido a que el 2,4-DNP es un desacoplante y la azida de sodio es un inhibidor de la enzima (ATP-asa) que es la encargada de hidrolizar el ATP. Discusión

La teoría quimiosmótica de la síntesis del ATP: Para poder entender la relación entre el funcionamiento de la cadena respiratoria y la síntesis de ATP, se deben tener presentes algunos aspectos importantes como la creación del gradiente de protones por la cadena respiratoria entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana y segundo, la presencia de la membrana interna de un complejo proteico que va a permitir a partir de dicho gradiente, la síntesis de ATP. Este complejo se conoce como la ATP-sintasa o complejo V. (Fornaguera & Gomez 2001) Este gradiente se origina como producto del funcionamiento de la cadena respiratoria que utilizando la fuerza electromotriz de los electrones, favorece el paso de protones de la matriz hacia el espacio intermembrana; de esta manera, se aumenta la concentración de protones en el espacio intermembrana y se establece un gradiente o diferencia entre las dos regiones separadas por la membrana interna de la mitocondria. (Fornaguera & Gomez 2001) El gradiente que se crea tiene dos componentes, uno de concentración y otro eléctrico; por eso recibe el nombre de gradiente electroquímico. Un gradiente siempre contiene una

energía –inherente a esa diferencia que hace que las partículas, en este caso los protones, se vean impulsados por las cargas y por concentración (difusión) hacia la atriz mitoconcdrial (región con menor concentración de protones y además con una carga relativa negativa mayor que el espacio intermembrana). Como la membrana interna es tan impermeable, los protones no pueden pasar simplemente a través de ella; deben hacerlo a través de una proteína especifica (canal). Esta proteína es subunidad F0 de la ATP-sintasa. (Fornaguera & Gomez 2001) Los protones pasan por F0 hacia la matriz impulsados por las dos fuerzas mencionadas; cuando llegan a F1 producen cambios conformacionales complejos en sus subunidades proteicas y estimulas la síntesis de ATP y su liberación a la matriz mitocondrial. En otras palabras, el paso a los protones se convierte en la fuerza motriz de la síntesis y la liberación de la modena energética de la célula: el ATP; las moléculas de ATP sintetizadas se liberan a la matriz mitocondrial por la F1.(Fornaguera & Gomez 2001) Existen muchos agentes que pueden alterar la síntesis de ATP asociada a la cadena respiratoria. De acuerdo con los mecanismos de acción de pueden clasificar en desacoplantes e inhibidores del transporte de electrones, los inhibidores de la ATP-sintasa y los inhibidores de la ATP-translocasa. (Foranguera & Gómez, 2004) Los desacoplantes son sustancias que evitan en acopla entre el transporte de electrones y la fosforilación de ADP para sintetizar el ATP. (Foranguera & Gómez, 2004). El 2,4dinitrofenol funciona como un transportador de protones (H+); como consecuencia se genera un aumento en la conducción de electrones a lo largo de la cadena respiratoria sin un aumento proporcional de la síntesis de ATP. El efecto del 2,4-dinitrofenol causa un efecto dramático pues no solo disminuye el gradiente eléctrico sino que también disminuye el gradiente químico. (Foranguera & Gómez, 2004) Al realizar la práctica cuando se le agrego glucosa a la solución con levadura, en ella se incremento la producción de ATP en el citosol, por el aumento en la acción de la ATPasa, que utiliza la energía liberada por hidrolizar el ATP para transportar iones H+ al exterior celular, de manera que se genera un gradiente, el cual es utilizado para el ingreso de la glucosa. Una vez en el interior de la célula, la glucosa se utiliza para producir energía y para mantener los gradientes, mientras que el medio extracelular se acidifica con la salida de iones H+, lo cual se logra observar con la disminución del pH al transcurrir el tiempo (Figura No. 1)(Quesada, 2007). Como se observó en los resultados, la adición del 2,4-dinitrofenol produjo una disminución del pH, esto debido a que la concentración de H+ extracelular disminuye al ser captado y transportado al interior de la levadura mediante el desacoplante. Como consecuencia, en el interior de la célula de levadura se acumula ADP y se interrumpe la proporción ADP/ATP.

Los inhibidores de la Cadena de Transporte de Electrones (CTE) son substancias que se enlazan a alguno de los componentes de la cadena de transporte de electrones bloqueando su capacidad para cambiar de una forma reversible desde la forma oxidada a la forma reducida y viceversa. (Melo & Cuamatzi, 2006) Esta inhibición resulta en una acumulación de los componentes en sus formas reducidas antes del punto de inhibición, y la presencia de las formas oxidadas de los componentes de la CTE después del punto de inhibición. (Melo & Cuamatzi, 2006) La azida de sodio es un compuesto iónico que consta de un ión sodio y un anión azida, es un grupo con fuerte carga negativa, que afectan a la cadena respiratoria de una forma muy similar al cianuro, inhibiendo a los grupos Hem de los citocromos en la Citocromo Oxidasa (Complex IV). Catalizado la transferencia de electrones desde el citocromo C al oxigeno, de la cadena respiratoria que se encuentra en la mitocondria unida fuertemente a la zona hemoa3 (Fe2+) (zona oxidada) y esto impide que se logre la transferencia de electrones desde el hemoa al centro binuclear, lo cual da a entender que el oxígeno no podrá ser absorbido en el núcleo del citocromo y además que esto desestabilizara el gradiente necesario para generar la fuerza protón-motriz, encargada de otorgarle la energía a la ATPsintasa para la síntesis de ATP, lo cual explica que al agregar la azida de sodio se observara que el nivel de acidez en el exterior de la membrana plasmática disminuyera aún más que al utilizar el 2,4-dinitrofenol (Berg,et al 2008). Como resultado de la accion de cualquiera de estos inhibidores, se detienen las reacciones redox de la cadena respiratoria, no se libera energía, las bombas de protones no funcionan, por lo que no hay protones que regresen a través del complejo V, y la producción de ATP cesa. (Melo & Cuamatzi, 2006) En el laboratorio se tomaron las medidas del pH de la solución de levadura con glucosa, observándose un rápido decrecimiento del pH en función del tiempo. La velocidad de oxidación de la glucosa se ajusta para satisfacer las necesidades de ATP de la célula. (Lodish, Berk et al. 2006) En conclusión se puede decir que el desacoplante y el inhibidor afectan negativamente el transporte de protones en la membrana, lo cual afecta la entrada de glucosa en la membrana y baja la producción de ATP en la célula

Bibliografía Alberts B. Bray D. Introducción a la biología celular.(2004). 2° edición. Editorial médica Panamericana. Madrid-España Pp 459-467 Berg, J. Stryler, L. Tymoczko, J.2008. Bioquímica. Reverté S.A Ed. Barcelona, España. Pág. 534 Fornaguera J. & Gómez G. Bioquímica, la ciencia de la vida (2004). 1° edición. Editorial Universidad Estatal a distancia EUNED. San José-Costa Rica Pp 25. Melo V & Cuamatzi O. Bioquímica de los procesos metabólicos (2006).Editorial Reverté. Barcelona-España. Pp 221 Quesada, S. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Universidad Estatal A Distancia Ed. San José. Costa Rica. Pág 115. Revista latinoamericana de microbiología. México DC-México. Volumen 41, N° 2 MX ISSN -0034-9771. P 95 Abril-Junio 1999. Editada por la asociación mexicana de microbiología. Editorial BOARD Lodish H. Berk A. Matsudaira P. Kaiser C. Krieger M. Scott M. Zipursky L. Darnell J. Biología celular y molecular (2006) 5° edición. Editorial médica Panamericana. Buenos Aires-Argentina. Pp 315